Erfassen Sie zunächst die Bilder von immungefärbten HCC-Schnitten. Laden Sie QuPath 0.4.3 herunter und öffnen Sie es. exe-Datei auf dem Computer.
Erstellen Sie einen neuen Ordner mit einem geeigneten Namen für die Organisation von QuPath-Projekten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Projekt erstellen in der oberen linken Ecke der Software und wählen Sie den neu erstellten Ordner aus. Ziehen Sie dann die gescannten Bilder in das QuPath-Softwarefenster.
Sobald ein neues Fenster angezeigt wird, wählen Sie "Bildtyp festlegen" und klicken Sie auf "H-DAB", gefolgt von "Importieren". Um die importierten Bilder anzuzeigen, überprüfen Sie die Liste im linken Fenster des Menüs und doppelklicken Sie auf ein Bild, um es zu öffnen. Wählen Sie Datei aus dem Hauptmenü aus und speichern Sie die Bilder als Projekt.
Wählen Sie im Hauptmenü die Pinsel- oder Zauberstabwerkzeuge, um den Tumorbereich zu kommentieren. Bei diskontinuierlichen Tumorregionen ist jede Region separat zu annotieren. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie alle Regionen auswählen.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie Mehrere bearbeiten und wählen Sie Ausgewählte zusammenführen. Klicken Sie anschließend im Hauptmenü auf Automatisieren und wählen Sie Skripteditor anzeigen. Kopieren Sie das gewünschte Skript, fügen Sie es in den Skript-Editor ein und klicken Sie dann auf Ausführen.
Alternativ können Sie das Polylinien-Werkzeug aus dem Hauptmenü auswählen, um genau einen Rand zu zeichnen, der die bösartigen Zellnester und das angrenzende Nicht-Tumorgewebe trennt. Wählen Sie dann den Rahmen aus dem Hauptmenü aus, wählen Sie Objekte aus, klicken Sie auf Anmerkung und wählen Sie Anmerkungen erweitern. Stellen Sie den Expansionsradius auf 500 Mikrometer ein und wählen Sie flach für den Linienabschluss.
Aktivieren Sie "Innenraum entfernen" und stellen Sie sicher, dass "Auf übergeordnetes Element beschränken" aktiviert ist. Klicken Sie nun mit der rechten Maustaste auf die neu erstellte Anmerkung. Wählen Sie Edit Single und dann Split aus.
Um die annotierten Bereiche korrekt zu benennen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Anmerkung in der Liste auf der linken Seite. Wählen Sie Set-Eigenschaften und geben Sie die entsprechenden Namen für die inneren und äußeren Randbereiche ein. Definieren Sie den verbleibenden Tumorbereich als Tumorzentrum.
Verlängern Sie den 500 Mikrometer breiten Peritumorbereich neben dem äußeren Rand, wie zuvor gezeigt. Für eine detaillierte Pixelanalyse wählen Sie das Rechteck-Werkzeug aus dem Hauptmenü aus. Versehen Sie dann einen Bereich mit Anmerkungen, der alle zu unterscheidenden Pixeltypen umfasst.
Navigieren Sie anschließend zum Hauptmenü. Wählen Sie "Analysieren" und klicken Sie auf "Vorverarbeitung". Klicken Sie dann auf Fleckenvektor schätzen.
Wenn Sie den visuellen Fleckeneditor aktivieren, wählen Sie "Automatisch" und klicken Sie auf "OK". Nennen Sie den geschätzten Färbevektor H-DAB. Für die Pixelanalyse besteht eine alternative Methode darin, das Rechteck-Werkzeug aus dem Hauptmenü zu verwenden, um einen kleinen Abschnitt eines mit Hämatoxylin gefärbten Zellkerns hervorzuheben.
Rufen Sie als Nächstes das linke Menü auf und wählen Sie das Bild aus. Doppelklicken Sie dann auf den ersten Fleck und wählen Sie Ja. Verwenden Sie auch hier das Rechteckwerkzeug, um einen kleinen Bereich mit Anmerkungen zu versehen, die eine positive Färbung mit DAB zeigen.
Wählen Sie danach im linken Menü das Bild aus und doppelklicken Sie auf den zweiten Fleck, gefolgt von Ja. Um den Flächenanteil positiver Immunzellen aus dem Hauptmenü zu bewerten, klicken Sie auf die Option Klassifizieren, wählen Sie Pixelklassifizierung und klicken Sie auf Schwellenwert erstellen. Stellen Sie danach die Auflösung auf hoch, wählen Sie den DAB-Kanal und wenden Sie einen Gaußschen Vorfilter mit einem Sigma von 0,5 an.
Stellen Sie den Schwellenwert zwischen 0,2 und 0,3 ein. Definieren Sie Pixel über dem Schwellenwert als positiv und unterhalb des Schwellenwerts als negativ. Entscheiden Sie sich für die Auswahl des Bereichs für eine beliebige Anmerkung.
Geben Sie dem Klassifikator einen Namen. Klicken Sie dann auf Speichern, Messen und OK. Um die Ergebnisse zu dokumentieren, kopieren Sie die im linken Seitenmenü angezeigten Ergebnisse und übertragen Sie sie in eine Tabelle.
Wählen Sie als alternative Methode aus dem oberen Hauptmenü die Messgröße aus. Wählen Sie dann Annotationsmessungen anzeigen aus. Wählen Sie In Zwischenablage kopieren und fügen Sie diese Ergebnisse in eine Tabelle ein, um einen detaillierten Datensatz zu erhalten.
Klicken Sie abschließend mit der rechten Maustaste auf das Bild, navigieren Sie zur Mehrfachansicht und klicken Sie auf Viewer schließen, um das Bild zu schließen. Das CD117-Protein wurde überwiegend in den zytoplasmatischen Membranen abgerundeter Zellen im Tumorstroma und in paravaskulären Räumen beobachtet. CD117-positive Zellen wurden auch in Tumorkapseln und paravaskulären Bereichen des äußeren Randes und des Paratumors beobachtet.
Das NKp46-Protein wurde hauptsächlich in zytoplasmatischen Membranen abgerundeter Zellen in sinusförmigen Räumen, dem Stroma des Tumorzentrums und dem inneren Rand beobachtet. Nkp46-positive Zellen wurden in Kapseln um Tumornester und Stroma von Pfortadern am äußeren Rand und in der Peritumorregion beobachtet. Das CD1a-Protein wurde hauptsächlich in den zytoplasmatischen Membranen abgerundeter Zellen beobachtet, entweder verstreut oder in Aggregaten im Stroma und in sinusförmigen Räumen im Tumorzentrum und in den inneren Randregionen.
CD1a-positive Zellen wurden in Sinusoiden und Gallenepithel in der Paratumorregion gefunden.
