Installieren Sie zunächst 0,5-Milliliter-Kammern im O2K-Respirometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schalten Sie das Gerät ein und verbinden Sie es mit der bereitgestellten Software zur Datenerfassung. Waschen Sie die Kammern dreimal mit entionisiertem Wasser.
Ersetzen Sie das Wasser durch 0,54 Milliliter MiR05 und schließen Sie die Stopfen vollständig. Nach Entfernen des überschüssigen Puffers die Stopfen anheben, damit sich der Raumsauerstoff mit dem Kammersauerstoff ausgleichen kann. Stellen Sie eine Säule in das Magnetfeld eines magnetischen Zellseparators und waschen Sie die Säule mit drei Millilitern RP5.
Resuspendieren Sie die frisch isolierte mononukleäre Zelle des peripheren Blutes oder PBMC-Pellet in 80 Mikrolitern RP5 zusammen mit 20 Mikrolitern Anti-CD14-Mikrokügelchen. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie die Zellen mit einem Milliliter RP5, bevor Sie die Suspension auf die Säule laden.
Sammeln Sie unmarkierte Zellen, die in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen fließen, das als "Durchfluss durch eins" gekennzeichnet ist. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern RP5, um den Durchfluss durch die Flüssigkeit aufzufangen. Nehmen Sie die Säule vorsichtig aus dem Magnetfeld und setzen Sie sie auf ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie fünf Milliliter RP5 hinzugefügt haben, schieben Sie den Kolben in die Säule, um den Inhalt in das Röhrchen zu sammeln.
Nachdem Sie den Fluss durch ein Röhrchen zentrifugiert haben, wiederholen Sie die Isolierungsschritte mit Anti-CD3-Mikrokügelchen mit den Zellen, um T-Lymphozyten zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Zellen, die CD3-positive T-Zellen und CD14-positive Monozyten enthalten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter RP5.
Bestimmen Sie mit einem Hämozytometer die Zellkonzentration. Geben Sie 2,5 Millionen Monozyten und 5 Millionen T-Zellen in neue Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen und suspendieren Sie sie in 20 Mikrolitern MiR05 wieder.
Installieren Sie die Fluoreszenzsensoren und starten Sie eine experimentelle Datei auf dem O2K-Respirometer. Stellen Sie mit den grünen LED-Leuchtstofflampen und dem AMR-Filtersatz die Fluorometerverstärkung und die Intensität auf 1000 ein. Stellen Sie das Kammervolumen auf 0,5 Milliliter ein und passen Sie das Layout so an, dass sowohl der Sauerstofffluss als auch die TMRM-Fluoreszenz angezeigt werden.
Sobald der Sauerstofffluss stabil ist, führen Sie die Luftsauerstoffkalibrierung gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Schließen Sie die Stopfen, um die Kammer abzudichten. Injizieren Sie mit einer Hamilton-Spritze viermal 2,5 Mikroliter 0,05 millimolaren Tetramethylrhodaminmethylester oder TMRM.
Kalibrieren Sie den Durchflusssensor mit einem Fluoreszenzsignal für jede Injektion, das 0, 0,25, 0,5, 0,75 und 1,0 Mikromolar TMRM darstellt. Injizieren Sie 20 Mikroliter MiR05, um das Blindexperiment durchzuführen. Nachdem sich der Sauerstofffluss stabilisiert hat, wählen Sie sowohl den Sauerstofffluss als auch das TMRM-Signal aus und beschriften Sie sie als Vorzelle.
Injizieren Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension, die die Zellen enthält, und messen Sie sie etwa 10 Minuten lang. Wählen Sie dann sowohl den Sauerstofffluss als auch die TMRM-Signale aus und beschriften Sie sie als Zellen. Wiederholen Sie dann die Schritte für jede Behandlung nacheinander und beschriften Sie den Sauerstofffluss und das TMRM-Signal entsprechend.
Sobald der Sauerstofffluss stabil ist, injizieren Sie einen Mikroliter 1,25 millimolare Antimycin A, um die mitochondriale Atmung zu hemmen. Stellen Sie für jedes leere Experiment die TMRM-Konzentration vor der Probe auf eins ein, um das Hintergrundverhältnis zu berechnen. Berechnen Sie die anschließende proportionale Abnahme der TMRM und das durchschnittliche Hintergrundverhältnis aus allen Blindexperimenten.
Multiplizieren Sie dann die TMRM vor der Stichprobe des Probenexperiments mit dem durchschnittlichen Hintergrundverhältnis für jede Injektion jedes Probenexperiments. Subtrahieren Sie den Hintergrund des Experiments von den gemessenen TMRM-Werten der Probe. Subtrahieren Sie als Nächstes das FCCP-hintergrundkorrigierte mitochondriale Membranpotential von jeder Injektion.
Um die ADP-gesteuerte Abnahme zu normalisieren, legen Sie das höchste und das niedrigste Membranpotential auf 100 % bzw. 0 % fest, und passen Sie die Daten in ein nichtlineares Anpassungsregressionsmodell ein. Vergleichende Studien zu ADP-bedingten Veränderungen in T-Zellen und Monozyten von gesunden Probanden zeigten, dass Monozyten im Vergleich zu T-Zellen einen größeren Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials aufwiesen. Die halbmaximale inhibitorische Konzentration von ADP auf dem mitochondrialen Membranpotential war für Monozyten im Vergleich zu den T-Zellen niedriger.
Ein typischer Dosis-Wirkungs-Anstieg des Sauerstoffverbrauchs bei ADP wurde bei keinem der Zelltypen nachgewiesen.
