Beginnen Sie mit der Beschichtung der extrazellulären Matrix auf Zellkultureinsätzen für Organoid-abgeleitete 2D-Monolayer-Kulturen. Tragen Sie 100 Mikroliter extrazelluläre Matrixbeschichtung auf die apikale Kammer jedes vorbereiteten Zellkultureinsatzes auf und setzen Sie den Deckel wieder auf. Anschließend wird die Zellkulturplatte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eine Stunde lang inkubiert.
Bei rektalen Organoidzellen wird nach der Inkubation die extrazelluläre Matrixbeschichtung durch rektales Monolayer-Kulturmedium ersetzt und über Nacht inkubiert. Nach dem enzymatischen Verdau der Organoide und der Filtration in einzelne Zellen zentrifugiert man die Zellsuspension bei 200 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und verwirft dann den Überstand. Bereiten Sie anschließend 200 Mikroliter der Zellsuspensionen pro Zellkultureinsatz in Monolayer-Kulturmedien vor.
Entnehmen Sie die 24-Well-Zellkulturplatte mit extrazellulärer Matrix, die mit extrazellulärer Matrix beschichtete Zellkultureinsätze enthält. Entleeren Sie die apikale Kammer jedes Zellkultureinsatzes vorsichtig mit einer Vakuumabsaugung, um eine Beschädigung der Beschichtung zu vermeiden. Tragen Sie vorsichtig 200 Mikroliter der Einzelzellsuspension auf die apikale Kammer jedes Zellkultureinsatzes auf.
Geben Sie 500 Mikroliter des entsprechend ergänzten Monolayer-Kulturmediums in die basolaterale Kammer jeder Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte dann in einem befeuchteten Inkubator, um die Zelladhäsion und das Zellwachstum zu fördern, und bilden Sie eine konfluente 2D-Monoschicht auf dem Zellkultureinsatz. Wechseln Sie die Nährmedien sowohl in der apikalen als auch in der basolateralen Kammer jeden zweiten Tag, beginnend 48 Stunden nach der Zellaussaat.
Für die Immunfluoreszenzfärbung von Organoid-abgeleiteten 2D-Monolayern schneiden Sie die Membran des Zellkultureinsatzes vorsichtig mit einer Skalpellklinge aus und legen Sie den Zellkultureinsatz auf einen Objektträger. Legen Sie Eindeckmittel auf ein Deckglas und legen Sie es auf den Objektträger, bevor Sie die Zellen betrachten. Einen Tag nach der Aussaat dissoziierter reifer Organoide auf einen Zellkultureinsatz schien sich eine 2D-Monoschicht zu bilden.
Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte fünf Tage nach der Aussaat gut entwickelte Mikrovilli und zelluläre Abgrenzung auf der apikalen Oberfläche der 2D-Monoschichten. Die Immunfluoreszenzfärbung der 2D-Monoschichten bestätigte das Vorhandensein von apikalen Bürstenrand, basolateralen Adhärenzverbindungen und schleimproduzierenden Becherzellen sowohl in ilealen als auch in rektalen Organoid-abgeleiteten 2D-Monoschichten.
