Beginnen Sie mit der Dissoziation des Gewebes. Verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um das Fettgewebe aus dem Brustgewebe zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das verbleibende Brustgewebe etwa ein Gramm wiegt.
Spülen Sie das Brustgewebe fünf Sekunden lang in fünf Millilitern 75%iger Ethanollösung. Waschen Sie dann zweimal für jeweils fünf Minuten mit 20 Millilitern Waschlösung. Verwenden Sie dann zwei chirurgische Klingen, um das Brustgewebe in kleinere Fragmente zu schneiden.
Um ein Gewebehomogenat zu erhalten, wird das zerkleinerte Gewebe 15 Minuten lang in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Fügen Sie 10 Milliliter Dispase- und Kollagenaselösung, drei Milliliter 0,25% Trypsin und sieben Milliliter PBS hinzu, um insgesamt 20 Milliliter Aufschlusslösung zu erhalten. Legen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie es 1 1/2 Stunden lang, wobei Sie das Röhrchen alle 20 Minuten schütteln.
Um den Verdauungsprozess zu stoppen, fügen Sie 20 Milliliter Neutralisationslösung hinzu. Pipettieren Sie dann den Inhalt etwa 15 Mal, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Filtrieren Sie die Mischung durch einen 100-Mikron-Maschenfilter.
Danach fünf Minuten lang bei 156 g zentrifugieren. Entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie die Inkubation des Pellets mit 20 Millilitern Neutralisationslösung und mischen Sie es dann durch Pipettieren.
Erneut fünf Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 Millilitern Anfangskulturmedium. Plattieren Sie die Zellsuspension in einer 100-Millimeter-Zellkulturschale.
Kultivieren Sie die Zellen in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie das ursprüngliche Kulturmedium jeden dritten Tag durch frisches Epithelzellmedium. Überprüfen Sie die Zellen und aktualisieren Sie das Medium alle zwei Tage.
Mit Hilfe dieses Protokolls wurden humane Brustepithelzellen aus Brustgewebe isoliert. Die Postisolationsanalyse zeigte, dass Zellen, die mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe ein ausgeprägtes Wachstum aufwiesen. Der CCK-8-Assay zeigte, dass Zellen in dem Medium, das Y-27632 enthielt, mit einer signifikant höheren Rate proliferierten als die Zellen im Kontrollmedium.
Immunfluoreszenz-Assays bestätigten, dass die Mehrzahl der Zellen die Brustepithelzellmarker CK7 und GATA3 exprimierte, während in den nachfolgenden Passagen andere Zelltypen vernachlässigbar vorhanden waren. Darüber hinaus zeigten qRT-PCR-Studien konsistente Expressionsniveaus von CK7 und GATA3 über mehrere Passagen, was auf einen konsistenten Phänotyp oder eine konsistente Differenzierungskapazität hinweist.
