Entnehmen Sie zunächst anästhesierte Zebrafischembryonen in E3-Puffer. Nachdem Sie die Embryonen mit der gewünschten Fluoreszenz ausgewählt haben, visualisieren Sie ihren Herzschlag unter einem Hellfeld-Stereomikroskop. Entnehmen Sie mit einer Transferpipette mit breiter Spitze bis zu drei Embryonen und übertragen Sie sie auf eine untere Glas-Speicherfolie.
Ersetzen Sie unter einem Stereomikroskop mit einer Pipette das Medium um die Embryonen herum durch eine 1%ige niedrigschmelzende Agaroselösung. Schieben Sie jeden Embryo mit einer dünnen, sich verjüngenden Plastikspitze, die an einer Nadel befestigt ist, vorsichtig an den Boden der Speicherfolie und richten Sie die Rückenseite so aus, dass sie zum Glas zeigt. Montieren Sie den Embryo in ein inverses konfokales Mikroskop.
Klicken Sie auf die eingestellte Voxelgröße, um sie zu überprüfen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Alle starten, um die Dateikonvertierung in das IMS-Format zu starten. Lassen Sie die Analysesoftware nach dem Start in der Arena starten. Klicken Sie auf Ordner beobachten, um die zuvor konvertierte Datei zu öffnen.
Nachdem die Datei in die Software geladen wurde, klicken Sie auf die Slice-Ansicht, um durch den Z-Stapel zu scrollen. Messen Sie mit dem Schieberegler in der Symbolleiste "Segment" die Zellendurchmesser, nachdem Sie den Durchmesser der ausgewählten Zellen mit dem Mauszeiger gezeichnet haben. Klicken und ziehen Sie die Maus, um Segmente zu zeichnen, die sich über den Zellkern erstrecken, und beobachten Sie die Länge des Segments, das in der Messsymbolleiste rechts neben dem Ansichtsbereich gezeichnet wird.
Um die Zellen automatisch zu erkennen, kehren Sie zur 3D-Ansicht zurück und klicken Sie auf das Spot-Symbol in der Objektsymbolleiste, um ein neues Spots-Objekt in der Objektliste hinzuzufügen, und öffnen Sie den Assistenten zur automatischen Erstellung von Spots. Wählen Sie im ersten Schritt des Assistenten die Option, nur einen Interessenbereich zu segmentieren. Aktivieren Sie dann die Option "Spots im Zeitverlauf verfolgen", um die Tracking-Daten zu berechnen, sowie die Objekt-Objekt-Statistik, um einen Vergleich zwischen Spots zu ermöglichen und den Datenbereich zu erweitern.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter unten rechts im Assistentenfenster. Geben Sie einen Interessenbereich oder ROI-Bereich an, der das optische Tectum des Embryos umschließt. Klicken und ziehen Sie die kleinen weißen Pfeile auf jeder Seite, um die Größe des ROI zu ändern.
Erweitern Sie es dann auf alle aufgezeichneten Bilder mit Zeitintervallanpassungen. Wählen Sie dann einen Quellkanal aus und legen Sie die zuvor erhaltene Messung des Zellendurchmessers als geschätzten XY-Durchmesser fest. Aktivieren Sie die Option Hintergrundsubtraktion und klicken Sie auf Weiter.
Geben Sie die Intensitätsschwellenwerte direkt in die unteren und oberen Schwellenwertfelder ein, um die Erkennung aller Zellen sicherzustellen. Klicken Sie auf Ansichtsbereich, um all diese Veränderungen in Echtzeit zu beobachten. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf Weiter, um den ausgewählten Qualitätsschwellenwert zu validieren, und klicken Sie auf Ansichtsbereich, um Spots zu visualisieren, die diese beiden Parameter erfüllen, die dem Quellkanal überlagert sind.
Wählen Sie als Nächstes die Option "Autoaggressive Bewegung" als Tracking-Algorithmus aus, um Zellen mit einer mehr oder weniger kontinuierlichen Bewegung zu verfolgen. Beobachten Sie die Bewegung der Punkte zwischen zwei Frames, um die längste Entfernung zu beurteilen, die eine Zelle zwischen zwei Zeitpunkten zurücklegt, und geben Sie eine geschätzte Zahl in das Feld "Maximale Entfernung" ein. Wenn das Intervall zwischen den Frames weniger als 60 Sekunden beträgt, verwenden Sie zum Festlegen der maximalen Abstandsgröße eine Größe von drei und erhöhen Sie für längere Zeitintervalle die Größe.
Aktivieren Sie die Fülllücken mit allen erkannten Objekten, um den Erkennungsschwellenwert zu senken und Spuren zu verbinden. Klicken Sie dann auf Weiter und lassen Sie die Software automatisch Tracks für alle zuvor generierten Spots generieren. Wenn die erhaltenen Spuren zahlreich oder fragmentiert sind, kehren Sie mit der Schaltfläche Zurück zum Erstellungsassistenten zurück und passen Sie die zuvor definierte maximale Entfernung an.
Um die Tracks auszuschließen, die kürzer als drei bis acht Minuten sind, geben Sie den Wert direkt in das Datenfeld für die Untergrenze des Filters für die Trackdauer ein. Klicken Sie auf Weiter, um den Filter zu validieren, und fahren Sie mit dem Erstellungsassistenten fort. Entfernen Sie die von Hautmakrophagen erzeugten Spuren manuell aus der Analyse, um sich auf die parenchymalen Mikroglia des Gehirns zu konzentrieren.
Korrigieren Sie mit dem Streckeneditor manuell andere potenzielle Fehler in den Tracks. Aktivieren Sie rechts neben dem Ansichtsbereich die kreisförmige Schaltfläche "Modus auswählen" und markieren Sie Spuren, die Änderungen oder Anpassungen erfordern. Nachdem Sie die problematische Spur mit den Schaltflächen Verbinden und Trennen ausgewählt haben, bearbeiten Sie sie so, dass die Zellenbewegungen korrekt dargestellt werden.
Wählen Sie im Spureditor den Kreisauswahlmodus aus, um duplizierte Einzelpunkte zu löschen. Wenn Sie den Mikroglia-Reporter mit anderen fluoreszenzmarkierten Parenchymzellen verwenden, passen Sie den geschätzten XY-Durchmesser und den maximalen Abstand zur neuen Zellpopulation an. Ändern Sie den Eingang des Quellkanals in das Bild.
Extrahieren Sie abschließend auf der Registerkarte Statistik die gewünschten Tracking-Statistiken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen und wählen Sie die Statistiken für die Berechnung jedes zuvor erstellten Spot-Objekts oder Oberflächenobjekts aus. Das Gehirn des embryonalen Zebrafisches wurde in seiner Gesamtheit abgebildet und die Lage der Neuronen in Bezug auf die Mikroglia sichtbar gemacht.
Die räumlichen Daten, die mit diesem Protokoll erhalten werden, zeigen die durchschnittliche Geschwindigkeit von Mikrogliazellen, die durchschnittliche Entfernung, die sie in einer Stunde zurücklegen, ihre mittlere quadratische Verschiebung und ihre Verteilung im Raum zu verschiedenen Zeiten.
