Übertragen Sie zunächst die herausgeschnittenen Eierstöcke eines Zebrafisches auf eine Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern Zelldissoziationslösung. Inkubieren Sie die Eierstöcke bei 28,5 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden. Geben Sie zwei bis drei Milliliter vorgewärmtes L15-Medium in den Puffer, um die Verdauung zu stoppen.
Legen Sie als Nächstes ein 70-Mikrometer-Zellensieb in eine andere Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Geben Sie L15 Medium in die Vertiefung und stellen Sie sicher, dass der mittlere Füllstand höher ist als das Sieb. Ziehe nun mit einer Pipette das Verdauungsmedium durch das Zellsieb.
Entfernen Sie das überschüssige Medium mit einer Pipette. Geben Sie vier Milliliter frisches L15-Medium in die Vertiefung und resuspendieren Sie die Eizellen vorsichtig. Pipettieren Sie nach ein paar Minuten den Überstand heraus.
Um die Eizellen für die Qualitätskontrolle auszuwählen, werden sie in eine 35 Millimeter breite Schale mit frischem L15-Medium überführt. Betrachten Sie die Eizellen unter einem Lichtmikroskop mit einer Vergrößerung von 10x oder mehr. Verwenden Sie ein stumpfes Injektionswerkzeug, um Zellfragmente, Eizellen im ersten Stadium oder Eizellen im anderen Stadium zu entfernen.
Zur Bestätigung des Wachstumsstadiums Hoechst 33342 in das L15-Medium mit den Eizellen geben und inkubieren. Betrachten Sie die Eizellen mit einem Fluoreszenzmikroskop unter UV-Laseranregung. Wählen Sie die Eizellen, die die gewünschten Kriterien nicht erfüllen, vorsichtig mit einer Nadel aus.
Der juvenile Eierstock zeigte eine Fülle von transparenten Eizellen im ersten Stadium, begleitet von einer kleineren Population von Eizellen im zweiten Stadium. Die Eierstöcke adulter Fische zeigten eine Dominanz von undurchsichtigen Eizellen im Spätstadium zwei bis drei Eizellen. Die Referenzmethode führte zu zahlreichen gefärbten Granulosazellkernen auf der Oberfläche der Eizellen, die die Eizellen dicht umhüllen.
Im Gegensatz dazu ermöglichte die modifizierte Methode die Trennung von Eizellen im ersten Stadium ohne Granulosazellkernfärbung.
