Nachdem Sie den Kiefernsäger, Monochamus alternatus Käfer, gesammelt haben, legen Sie den Käfer in ein steriles Röhrchen mit frischen Zweigen. Ziehen Sie die Käfer in einem nicht befeuchteten Brutkasten bei 25 Grad Celsius auf. Nach der Inkubation zeigen die Rekordkäfer eine verminderte Nahrungsaufnahme und Mobilität.
Bringen Sie die steifen toten Käfer in nasse Kammern. Zerlege die Käfer mit Pilzinfektionen in Hauptpositionen wie Antennen, Kopf, Thorax, Bauch, Flügel und Beine. Schneide mit einer Schere die Integumente jeder Position in kleine Stücke.
Drücken Sie die Außenfläche dieser Stücke vorsichtig auf die PDA-Platte, die Antibiotika enthält. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius, bis das Gewebe vollständig mit Myzel bedeckt ist. Übertragen Sie dann die einzelne Kolonie entsprechend den phänotypischen Eigenschaften auf eine neue PDA-Platte.
Extrahieren Sie die genomische DNA mit dem genomischen DNA-Isolierungskit für Pilze. Bereiten Sie eine PCR-Mischung mit den Primern ITS1 und ITS4 vor, um die rDNA-ITS-Region der DNA zu amplifizieren. Verwenden Sie eine Kamera, um die Morphologie der reifen, pilzlichen reinen Kolonie auf der Vorder- und Rückseite der PDA-Platte zu erfassen.
Aus den reinen Pilzkolonien werden mit einer Impfnadel Konidien gezupft und mit einem Tropfen sterilem Wasser auf einen Objektträger gegeben. Legen Sie dann ein Deckglas über die Probe, ohne Blasen zu bilden. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen fünf Millimeter großen Agarblock vom Rand der Pilzkolonie ab und geben Sie ihn mit einem Tropfen sterilem Wasser auf einen sauberen Glasobjektträger.
Trennen Sie die Pilze vorsichtig mit einer feinen Nadel vom Agar, um bestimmte Strukturen zu beobachten. Beobachten Sie unter einem optischen Mikroskop die asexuelle Morphe der Pilze, einschließlich der Haltung der Hyphen, Konidiophoren, Phialiden und Konidien.
