Sterilisieren Sie zunächst die Oberfläche eines 24 Stunden ausgehungerten Monochamus alternatus und Tribolium castaneum Käfers mit Bleichmittel, Ethanol und destilliertem Wasser. Um die Pilzinfektion auszulösen, tauchen Sie zunächst die Zirbenzweige oder die Weizenkleie für 10 Sekunden in die Konidiensuspension. Tauchen Sie dann die Käfer in die Konidiensuspension.
Nach dem Trocknen einen Käfer und einen Zweig in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen geben. Ziehen Sie die Käfer in einem nicht befeuchteten Brutkasten bei 25 Grad Celsius auf. Nach der Inkubation werden die toten Käfer in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und ein Stück sterile, feuchte Watte in das Röhrchen gelegt.
Zerlege die infizierten Käferkörper mit Pilzinfektionen in Positionen wie Fühler, Kopf, Thorax, Bauch, Flügel und Beine. Schneiden Sie fünf Millimeter Scheibenstopfen von reifen Pilzkolonien ab. Legen Sie das infizierte Käfergewebe zwei Tage lang in vorgekühltes 2,5%iges Glutaraldehyd bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie die Proben anschließend dreimal fünf Minuten lang in 0,1 %iger Phosphatpuffer und dehydrieren Sie sie jeweils 10 Minuten lang in steigenden Ethanolkonzentrationen. Trocknen Sie die Proben in einem Vakuum-Gefriertrockner und beobachten Sie dann die Pilzstrukturen unter einem Rasterelektronenmikroskop. Behandeln Sie die Weizenkleie 10 Sekunden lang mit einer konischen Suspension und geben Sie sie nach dem Trocknen in eine Petrischale.
Tauchen Sie die T.castaneum-Käfer 10 Sekunden lang in die konidische Suspension, bevor Sie sie in die Petrischale mit der Weizenkleie legen. Zähle nach der Inkubation die toten Käfer von der Platte. Extrahieren Sie genomische DNA von parasitären entomopathogenen Pilzen mit dem genomischen DNA-Isolationskit für Pilze.
Bereiten Sie unter Verwendung der gegebenen Primersätze ein PCR-Reaktionsgemisch für die genspezifische Amplifikation vor. Richten Sie nach der Sequenzierung die Nukleotidsequenz mit ClustalX 2 aus. Führen Sie schließlich eine phylogenetische Analyse mit MEGA 6 auf der Grundlage der Maximum-Likelihood-Methode durch.
Parasitäre Pilze wie Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus und Scopulariopsis alboflavescens verursachten bei M. alternatus signifikante Infektionssymptome. REM-Beobachtungen bestätigten die morphologischen Eigenschaften dieser parasitären Pilze auf der Oberfläche der Käfer. Die entomopathogene Aktivität zeigte signifikant höhere Mortalitätsraten bei parasitären Pilzen im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Der phylogenetische Stammbaum mit mehreren Genen zeigte genetische Distanzen zwischen den drei parasitären Pilzarten und anderen Arten innerhalb ihrer jeweiligen Gattungen.
