Platzieren Sie zunächst die experimentelle weibliche Maus auf einer Arbeitsplattform. Intraperitoneal verabreichen Sie am ersten Tag gegen 20:00 Uhr 7,5 internationale Einheiten Trächtigkeitsserumgonadotropin. Nach 48 Stunden intraperitoneal 7,5 internationale Einheiten humanes Choriongonadotropin injizieren.
Teilen Sie den Deckel einer Zellkulturschale in eine obere und eine untere Hälfte. Geben Sie in die obere Hälfte vier bis sechs Tröpfchen mit je fünf Mikrolitern PVP für die Spermienplatzierung. Geben Sie 8 bis 10 Tröpfchen à fünf Mikroliter M2-Medium in die untere Hälfte für das ICSI-Verfahren.
Bedecken Sie die Tröpfchen PVP und M2 Medium mit ca. drei Millilitern Mineralöl. Nachdem Sie die Nebenhoden-Cauda von der euthanasierten männlichen Maus isoliert haben, tupfen Sie sie vorsichtig auf sterilisierte Gaze ab. Schneiden Sie die Cauda Epididymis auf und drücken Sie sie vorsichtig zusammen, indem Sie die Spermien mit einer Pinzette freisetzen und sie in vorbalancierten menschlichen Eileiterflüssigkeitsröhrchen sammeln.
Spülen Sie den Cauda Epididymis in der vorgewärmten Flüssigkeit für den menschlichen Eileiter. Stellen Sie das Röhrchen unbedeckt bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator für die Spermienkapazitation auf. Am vierten Tag nach der Injektion von humanem Choriongonadotropin wird die euthanasierte weibliche Maus unter ein Präpariermikroskop gelegt.
Reißen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel die Ampulle des Eileiters auf, um zahlreiche Kumulus-Eizellkomplexe freizusetzen. Nach der Kapazitation beschallen Sie 100 Mikroliter des Spermiums fünf Sekunden lang, um die Köpfe von den Schwänzen zu trennen. Füllen Sie die Mikromanipulationsnadel mit der Betriebsflüssigkeit und stellen Sie sicher, dass die gefüllte Portion 0,5 Zentimeter in der Nadel misst.
Montieren Sie die Nadel am rechten Arm des Mikromanipulators und sichern Sie sie, indem Sie die Haltekappe festziehen. Installieren Sie dann eine Mikromanipulationspipette mit flacher Spitze am linken Arm des Mikromanipulators. Positionieren Sie die Injektionsnadel und die Haltepipette im Sichtfeld des Mikroskops.
Bestimmen Sie unter einem Polarisationsmikroskop die Position der Metaphase-Spindel innerhalb der Eizelle, um sicherzustellen, dass sich der Spindelapparat nicht auf der Injektionsseite befindet. Bei Kontakt der Injektionsnadel mit der Zona pellucida werden Piezo-Impulse mit einer Intensität von fünf und einer Frequenz von eins aktiviert, wodurch eine Perforation in der Zona pellucida entsteht und die Injektionsnadel durchgelassen wird. Erzeugen Sie mit Piezo-Impulsen der Intensität eins und der ersten Frequenz eine kleine Pore in der Plasmamembran, um sicherzustellen, dass der Spermienkopf in das Ooplasma injiziert wird.
Mit einer atraumatischen Pinzette werden die Eierstöcke, Eileiter und die Gebärmutter der anästhesierten pseudoschwangeren weiblichen Maus vorsichtig nach außen geäussert. Machen Sie mit der Spitze einer Spritzennadel einen kleinen, nach oben geneigten Schnitt an der Gebärmutterwand unterhalb des uterotubalen Übergangs und vermeiden Sie dabei Blutgefäße. Führen Sie den Eileiter vorsichtig zwei bis drei Millimeter durch das kleine Loch ein.
Mit der ICSI-Methode wurde bei Mäusen eine Befruchtungsrate von 89,57 % erreicht, wobei 87,38 % der Zygoten innerhalb von 24 Stunden nach der ICSI in das 2-Zell-Embryostadium übergingen. Die Geburtenrate von lebenden Jungtieren nach dem Embryotransfer lag bei 42,5 %Es gab keine signifikanten Schwankungen des zufälligen Blutzuckerspiegels zwischen natürlich geborenen Mäusen und ICSI-Mäusen. Männliche ICSI-Mäuse wiesen jedoch durchweg erhöhte Nüchternblutzuckerspiegel auf, was auf eine gestörte Glukosehomöostase hindeutet.
In Glukosetoleranztests wurden signifikante Unterschiede im Blutzuckerspiegel zwischen männlichen ICSI- und Kontrollmäusen festgestellt, während bei weiblichen Mäusen kein Unterschied beobachtet wurde. Bei der Körpergewichtsmessung zeigten sowohl männliche als auch weibliche ICSI-Mäuse im Vergleich zu Kontrollen einen übergewichtigen Phänotyp.
