Nach der Durchführung der Immunhistochemie an den FFPE-Geweben werden die Schnitte mit dem digitalen Pathologie-Imager abgebildet. Starten Sie die Software, um die spektrale Entmischung der annotierten Bilder durchzuführen. Wählen Sie Datei aus, klicken Sie dann auf Bild öffnen und wählen Sie die QPTIFF-Dateien aus, um die Bilder in die Software hochzuladen.
Lassen Sie zu, dass die Stempel, die als informierte Projekte markiert sind, in das Projekt hochgeladen werden. Laden Sie die QPTIFF-Dateien, die für die Autofluoreszenzkompensation vorbereitet sind. Wählen Sie die Autofluoreszenz im Bildwerkzeug aus, um eine Linie auf dem Bild von der ungefärbten Folie durch autofluoreszierende Strukturen wie Erythrozyten und Kollagen zu zeichnen, um die Autofluoreszenz zu kompensieren.
Navigieren Sie dann zum Abschnitt "Marker und Farben bearbeiten". Weisen Sie Markernamen zu, die dem Opalfluorophor entsprechen, und passen Sie die Farbeinstellungen an Ihre bevorzugte Option an. Wählen Sie "Alle vorbereiten" in der unteren linken Ecke der Benutzeroberfläche, um die Entmischung der Fluorophore zu starten.
Untersuchen Sie alle Bilder, um die Sichtbarkeit aller Signale und den erfolgreichen Abschluss des Entmischungsprozesses zu überprüfen. Wählen Sie das Augapfelsymbol aus, um alle Marker nacheinander ein- und auszuschalten und die Qualität zu überprüfen. Navigieren Sie nun zur Registerkarte Exportieren und erstellen Sie ein neues leeres Exportverzeichnis, indem Sie auf die Schaltfläche Durchsuchen klicken, die sich unter dem Exportverzeichnis befindet.
Wählen Sie auf der Registerkarte Zu exportierende Bilder die Option Composite-Image und Component-Images Multi-Image TIFF aus. Navigieren Sie zur Registerkarte "Stapelanalyse", die sich vertikal auf der linken Seite für die Stapelverarbeitung von Folien befindet, und wählen Sie unter den Exportoptionen die Option "Separate Verzeichnisse für jedes Element erstellen" aus. Um Folien für die Analyse hinzuzufügen, wählen Sie unter der Schaltfläche Folien hinzufügen QPTIFF-Dateien aus und laden Sie diese in die Batch-Analyse.
Wählen Sie Ausführen aus, um die Stapelverarbeitung von Folien zu starten. Erstellen Sie einen neuen Ordner, der nur die Komponentendateien aus der spektralen Entmischung enthält, und stellen Sie sicher, dass die hierarchische Ordnerstruktur intakt bleibt. Starten Sie die gesamte Diabetrachter-Software.
Klicken Sie auf der linken Seite auf Projekt erstellen und erstellen Sie einen neuen leeren Ordner mit einem entsprechenden Namen oder wählen Sie ihn aus. Klicken Sie dann auf Automatisieren und wählen Sie Skript-Editor anzeigen aus. Kopieren Sie das vorhandene Skript, fügen Sie es ein, und ändern Sie den Speicherort, um es in den Ordner zu leiten, der alle Folienkomponentendateien enthält.
Wählen Sie Ausführen aus, um mit dem Stapelzusammenfügen von Folien zu beginnen, und warten Sie dann, bis er abgeschlossen ist. Verschieben Sie nun die kürzlich generierten OME-TIFF-Dateien in das QuPath-Projekt und speichern Sie sie als neues Projekt. Wenn ein neues Fenster angezeigt wird, wählen Sie "Bildtyp als Fluoreszenz festlegen" aus und klicken Sie dann auf die Taste "Importieren".
Navigieren Sie zum Menü auf der linken Seite, wählen Sie ein Sample aus der Liste aus und doppelklicken Sie, um das ausgewählte Sample zu öffnen. Passen Sie die Intensität der Kanäle an, indem Sie auf das Kontrastsymbol klicken, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Wählen Sie alle Kanäle aus und wählen Sie das Zurücksetzen.
Stellen Sie sicher, dass die Autofluoreszenz ausgeschaltet ist. Um einen Interessenbereich oder ROI für den Tumor zu zeichnen, klicken Sie erneut auf das Kontrastsymbol und wählen Sie dann Graustufen anzeigen. Wählen Sie danach den Tumormarkerkanal aus und passen Sie die Intensität für eine optimale Sichtbarkeit an.
Klicken Sie auf das Pinselwerkzeug, um einen ROI um den Tumor zu zeichnen. Klicken Sie auf das eine Werkzeug und passen Sie den ROI an, während Sie die Alt-Taste drücken, um den ROI von außen zu glätten. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie alle getrennten Teile des Tumors zum gleichen ROI zusammen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die ROI-Anmerkung in der Liste auf der linken Seite, wählen Sie Eigenschaften festlegen und geben Sie einen geeigneten Namen ein. Zum Beispiel Tumor. Erweitern Sie den ROI für den invasiven Rand von der Tumorregion, indem Sie Objekte, dann Anmerkungen und dann Anmerkungen erweitern auswählen.
Wählen Sie die gewünschte Größe für den Erweiterungsradius. Wählen Sie Innenraum entfernen und auf übergeordnetes Element beschränken aus. Klicken Sie auf das Kontrastsymbol, wählen Sie den Autofluoreszenzkanal aus und passen Sie die Intensität für eine optimale Sichtbarkeit an.
Klicken Sie auf den Zauberstab und passen Sie den ROI an, während Sie die Alt-Taste drücken, um den ROI von außen zu glätten und alle Hintergründe zu entfernen, die nicht Teil dieses ROI sein sollten. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Anmerkung in der Liste auf der linken Seite. Wählen Sie dann Eigenschaften festlegen aus, um dem ROI einen geeigneten Namen zuzuweisen, z. B. invasiver Rand oder IM.
Falls gewünscht, ändern Sie die Farbe. Um die Anmerkungen zu exportieren, navigieren Sie zur Option Datei, klicken Sie auf Objektdaten, Als GeoJSON exportieren und wählen Sie Alle Objekte exportieren aus. Fahren Sie mit der Standardauswahl beim Exportieren als Feature-Sammlung fort, und speichern Sie sie an einem bevorzugten Speicherort.
