Injizieren Sie ein bis drei Milligramm Fluorophor-konjugierten Anti-Maus-CD45-Antikörper, verdünnt in 100 Milliliter normaler Kochsalzlösung intravenös in jede anästhesierte Maus. Beginnen Sie damit, für jede Maus vier Milliliter eiskalten HEPES-Puffer in einem speziellen Gewebedissoziatorröhrchen auf Eis zu legen. Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, legen Sie die resezierte Lunge in ihr jeweiliges Gewebedissoziatorröhrchen und kühlen Sie es auf Eis.
Legen Sie die Schläuche auf den automatisierten Gewebedissoziator und führen Sie das erste voreingestellte Programm für Lungengewebe aus. Geben Sie dann 500 Mikroliter Liberase-Stammlösung und 500 Mikroliter Aminoguanidin-Stammlösung in jedes Röhrchen, das das dissoziierte Lungengewebe enthält. Inkubieren Sie es auf einem Nuktionsmischer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Setzen Sie anschließend die Schläuche wieder auf den Dissoziator und führen Sie das zweite voreingestellte Programm für Lungengewebe aus. Gießen Sie nun die einzellige Suspension aus dem Gewebedissoziatorröhrchen durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das Gewebedissoziatorröhrchen mit fünf Millilitern vollständigem EHAA und geben Sie es durch das Sieb in das 50-Milliliter-Röhrchen.
Erhöhen Sie nach dem Entfernen des Siebs das Volumen der Zellsuspension auf 50 Milliliter mit vollständigem EHAA. Anstatt spezielle Gewebedissoziatorröhrchen zu verwenden, legen Sie die resezierte Lunge in die entsprechenden 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, die auf Eis gekühlt werden. Sobald alle Lungen entnommen wurden, übertragen Sie jede Lunge ohne Zellmedien in ein frisches Mikrofuge-Röhrchen.
Schneiden Sie die Lunge mit einer Schere in kleine Fragmente innerhalb des Mikrofugenröhrchens. Geben Sie einen Milliliter Liberase TM und DNase I Aufschlusscocktail in jedes Röhrchen. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad inkubieren.
Gießen Sie dann die Probe über ein 100-Mikrometer-Zellensieb, das auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gelegt wird. Pipettieren Sie die restliche Probe auf das Sieb. Zerdrücken Sie das Taschentuch mit dem Gummiende des Kolbens aus einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze gegen das Netz.
Spülen Sie das Sieb mit Kaltsortierpuffer und sammeln Sie ein Endvolumen von sieben Millilitern in der Tube. Unabhängig davon, ob die automatisierte oder die manuelle Dissoziationsmethode verwendet wird, zentrifugieren Sie die erhaltene Zellsuspension. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, wobei etwa 100 Mikroliter Überstand und das Zellpellet zurückbleiben.
Zum Schluss fügen Sie etwa 100 Mikroliter Fc-Blocklösung hinzu, um das Gesamtvolumen auf 200 Mikroliter zu erhöhen, und wirbeln Sie kräftig vortexen, um das Pellet wieder zu suspendieren.
