Isolierung und Aussaat von murinen subventrikulären neuralen Stammzellen (NSCs) für die Bildung von Neurosphären

Um Neurostammzellen oder NSCs aus den präparierten subventrikulären Neuronenzonen oder SVZ zu isolieren, schneiden Sie jede SVZ in vier bis fünf kleine Stücke, um die Disaggregation des Gewebes zu erleichtern. Übertragen Sie die gehackten SVZ mit einer sterilen Pasteurpipette aus Kunststoff in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass keine Fragmente in der Platte zurückbleiben. Lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens sedimentieren, bevor Sie das restliche DPBS entfernen.

Fügen Sie 500 Mikroliter gefilterte enzymatische Mischung für die beiden SVZs pro Gehirn hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation werden jeder Probe fünf Milliliter Kontrollmedium zugesetzt, das bei 37 Grad Celsius vorgewarnt wurde. Die Probe wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette oder einer Vakuumpumpe. Geben Sie mit einer feuerpolierten Weideglaspipette einen Milliliter Kontrollmedium in das Pellet. Disaggregieren Sie das Pellet vorsichtig mechanisch, indem Sie es 10 bis 20 Mal auf und ab pipettieren, bis eine homogene Zellsuspension erhalten wird.

Fügen Sie dann vier Milliliter Kontrollmedium hinzu und mischen Sie es durch Inversion, um die Zellen zu waschen. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei 300 g wird das resultierende Pellet in einem Milliliter des vollständigen Mediums durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren homogen wieder suspendiert. Nachdem ein Teil eines Aliquots der Zellsuspension mit einem Teil Trypanblau verdünnt wurde, werden die Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop gezählt.

Stellen Sie die zelluläre Disaggregation auf Einzelzellebene sicher, bevor Sie die Zellen gleichmäßig in acht Vertiefungen einer 48-Well-Platte in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern vollständigem Medium aussäen. Inkubieren Sie die Zellen fünf bis sieben Tage lang, damit sich die primären Neurosphären bilden können.