Bereiten Sie unter Verwendung des empfohlenen Kits 95 Mikroliter der Nukleofektionslösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen für jede gewünschte Nukleofektionsbedingung vor. Bereiten Sie außerdem einen T25-Kolben vor, der mit vier Millilitern vorgewärmtem Alleinmedium pro Zustand gefüllt ist, und bewahren Sie ihn bis zur Verwendung im Inkubator auf. Um eine Nukleofektion durchzuführen, zentrifugieren Sie die gewünschte Anzahl von Zellen fünf Minuten lang bei 300 G, bevor Sie den Überstand entfernen.
Fügen Sie einen Milliliter DPBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet homogen, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Nach Wiederholung der Zentrifugation das Pellet in 95 Mikrolitern Nukleofektionslösung wieder suspendieren. Kombinieren Sie die 95 Mikroliter Zellen mit einer vorgemischten Lösung, die fünf Mikroliter jedes für die Nukleofektion ausgewählten Plasmids enthält.
Nachdem diese Lösung in eine Küvette überführt wurde, legen Sie sie in die Nukleofektorvorrichtung, um die Zellen mit den Plasmiden unter Verwendung des optimierten neuralen Stammzellprogramms des Nukleofektorsystems zu nukleofektieren. Nach Beendigung der Elektroporation mit der im Kit enthaltenen Pasteur-Pipette vorsichtig warmes vollständiges Medium in die Küvette einführen. Der Inhalt der Küvette wird in den zuvor vorbereiteten T25-Kolben mit dem vorgewärmten vollständigen Medium überführt.
Inkubieren Sie die nukleofectierten Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei bis fünf Tage und visualisieren Sie die nukleofectierten Neurosphären.
