Fügen Sie zunächst 1,5 Milliliter 70%iges Ethanol zu 30 Milligramm 0,7-Mikrometer-Wolframpartikeln in einem Mikroröhrchen hinzu. Die Mischung bei 13, 200 g 15 Minuten lang zentrifugieren. Geben Sie 1,5 Milliliter steriles Wasser zu den Partikeln, dann vortexen und erneut zentrifugieren.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie den Wolframpartikeln 500 Mikroliter steriles 50%iges Glycerin hinzu. Um die Partikel zu beschichten, geben Sie zunächst fünf Mikrogramm eines Zwei-Mikron-Plasmids und 15 Mikrogramm eines bakteriellen Plasmids, das die mitochondriale Sequenz enthält, in ein Mikroröhrchen, das auf Eis gestellt wird. Geben Sie 100 Mikroliter der Wolframpartikelsuspension in das Rohr und wirbeln Sie es auf.
Fügen Sie dann vier Mikroliter einmolares Spermidin hinzu und wirbeln Sie erneut vortexen. Pipettieren Sie nun 100 Mikroliter eiskaltes 2,5-molares Calciumchlorid in das Röhrchen. Nachdem Sie die Suspension kurz vortext haben, inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.
Zentrifugieren Sie die Wolframpartikel bei 13.200 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann die Partikel in 200 Mikrolitern 100%igem Ethanol bei minus 20 Grad Celsius. Zum Schluss werden die Wolframpartikel in 60 bis 70 Mikrolitern 100 % Ethanol bei Raumtemperatur wieder suspendiert.
Um die biolistischen Materialien vorzubereiten, platzieren Sie sechs sterilisierte Makroträgerhalter auf einer sterilen Glasplatte. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Makrocarrier in jeden der sechs Makrocarrier-Halter einzuführen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der DNA-kodierten Wolframpartikel auf jede Makroträgeroberfläche und verteilen Sie sie mit der Pipettenspitze gleichmäßig über die gesamte Oberfläche.
Inokulieren Sie den Rho-Null-Heferezeptorstamm in zwei Millilitern YPR-Medium. Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem rotierenden Rad. Am nächsten Tag werden 300 Mikroliter der Kultur in ein Röhrchen mit 30 Millilitern frischem YPR-Medium umgefüllt.
Stellen Sie die Kultur zwei Nächte lang bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute auf einen Rotationsschüttler, bis die Kultur gesättigt ist. Zentrifugieren Sie die Hefezellen bei 600 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Zellen in 600 Mikrolitern YPD-Medium, nachdem Sie den Überstand verworfen haben.
Verteilen Sie nun mit einem sterilen Glasgriff 100 Mikroliter der Hefezellsuspension auf einer festen Bombardement-Medium-Platte. Nachdem Sie alle Kulturen verteilt haben, inkubieren Sie die Platten vor dem Beschuss ein bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur.
