Zu Beginn tupfen Sie mit einer Pipette fünf Mikroliter jedes Extrakts im Abstand von zwei Zentimetern auf die Punkte, die in der unteren Linie der Dünnschichtchromatographie (DC)-Platte markiert sind. Lassen Sie die Flecken auf der DC-Platte trocknen und wiederholen Sie den Vorgang, bis etwa fünf Milligramm jedes Extrakts auf die Platte geladen sind. Bereiten Sie eine 1:2-Lösung aus Dichlormethan und Methanol in einem DC-Entwicklungstank vor.
Legen Sie die DC-Platte in den Entwicklungstank und entwickeln Sie sie, bis das Lösungsmittel die Linie erreicht, die zwei Zentimeter von der Oberseite der Platte entfernt markiert ist. Entfernen Sie nach der Entwicklung die DC-Platte aus dem Tank. Erkennen Sie sofort die Positivkontrollen an den Punkten über der Lösungsmittellinie.
Legen Sie die Platte in eine ethanolsterilisierte DC-Plattenbox, bevor das gesamte Lösungsmittel verdampft ist. Kratzen Sie die Myzelmatte von den fünf Erregerplatten mit einem sterilen Metallspatel ab. Füllen Sie es dann in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um.
Nachdem Sie 25 Milliliter Kartoffel-Dextrose-Brühe mit Agar hinzugefügt haben, geben Sie sterile Glasperlen in das Röhrchen und wirbeln Sie es fünf Minuten lang, um die Myzelmatte aufzubrechen. Nachdem Sie das Chromatographie-Sprühgerät in der Haube montiert haben, befestigen Sie den Schlauch. Befestigen Sie dann den Durchflussmesser an der Einrichtung.
Übertragen Sie die Myzelsuspension mit einer sterilen Spritze mit einer Nadelspitze in das Chromatographie-Sprühgerät, um sicherzustellen, dass große Myzelstücke das Sprühgerät nicht verstopfen. Legen Sie die zuvor entwickelten DC-Platten auf sterile Papiertücher in die Laminar-Flow-Haube, um den Handkontakt mit der Platte zu reduzieren, während Sie die Mediensuspension auftragen. Schließen Sie die Erregerprobe an das zusammengebaute Sprühgerät an und tragen Sie drei Schichten der Suspension auf die DC-Platte auf, damit die Platte zwischen den Anwendungen vollständig trocknen kann.
Bereiten Sie als Nächstes die Inkubation vor, indem Sie 50 Milliliter steriles Wasser in eine sterilisierte Plastikplattenbox geben. Legen Sie vier Petriplatten hinein, auf denen die TLC-Platte sitzen kann. Legen Sie außerdem sterilisierte gefaltete Zelluloseblätter oder Filterpapier auf jede Seite der Schachtel, um die Feuchtigkeit zu speichern.
Legen Sie die fertige Assay-Platte auf vier leere Petrischalen in der Box. Inkubieren Sie den Assay drei Tage bis zu einer Woche lang oder bis eine gleichmäßige Myzelschicht über die Platte wächst, mit Ausnahme der Positivkontrollen und der Hemmzone. Kratzen Sie dann mit einem Metalllöffel die Kieselsäure von den Hemmzonen ab und geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen.
Geben Sie 500 Mikroliter Methanol in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es ein, um die Metaboliten aus der Kieselsäure zu extrahieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die Kieselsäure zu pelletieren, und übertragen Sie den Überstand zur Analyse in Flüssigchromatographie-Fläschchen. Die Bildgebung unter ultraviolettem Licht zeigte die Trennung der Metaboliten auf der DC-Platte.
Nach der Inkubation schien der Erreger gleichmäßig über die gesamte Platte zu wachsen, außer über die Positivkontrollen und die Hemmzonen.
