Legen Sie die euthanasierte Maus zunächst in Rückenlage auf die saubere Bank. Schneiden Sie entlang der Mittellinie des Mausbauchs und trennen Sie die Bauchstrukturen Schicht für Schicht. Öffnen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das große Omentum und den Bauch.
Ziehen Sie dann die Milz vorsichtig mit dem Magen-Darm-Band heraus und trennen Sie sie stumpf von den umliegenden Geweben und Bändern, um eine intakte Milz zu erhalten. Platzieren Sie einen 70-Mikron-Zellfilter in einer sterilen 100-Millimeter-Kulturschale. Geben Sie die Milz in das Zellsieb und zerkleinern Sie sie mit einem Spritzenkolben.
Geben Sie fünf bis acht Milliliter Homogenatspülflüssigkeit hinzu, um die Milzzellen durch den Filter in die Kulturschale zu drücken. Das Filtrat bei 450 g wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Suspendieren Sie das Pellet erneut mit dem Probenverdünnungsmittel, das mit dem Lymphozytentrennungskit geliefert wurde.
Nachdem Sie die Zellen auf einem Hämozytometer gezählt haben, stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 10 hoch acht Zellen pro Milliliter ein. Nehmen Sie in einem Zentrifugenröhrchen die gleiche Menge Lymphozytentrennungslösung wie die Einzelzellsuspension. Pipettieren Sie die Einzelzellsuspension vorsichtig auf die Oberfläche der Lymphozytentrennlösung und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 800 g bei 25 Grad Celsius.
Beobachten Sie nach dem Zentrifugieren die vier Schichten im Röhrchen von oben nach unten. Ziehen Sie mit einer Pipette die ringförmige, milchig-weiße Lymphozytenschicht vorsichtig in ein anderes Röhrchen. Geben Sie 10 Milliliter Reinigungslösung in das Röhrchen, um die Zellen zu mischen.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 g fünf Minuten lang. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern RPMI 1640 Medium zur Zellzählung.
