Bereiten Sie zunächst eine Maus-Milz-Einzelzellsuspension mit einer mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter in einem Volumen von 0,1 bis zwei Millilitern vor. Geben Sie 50 Mikroliter Rattenserum in die Probe. Füllen Sie die Probe in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen.
Geben Sie 50 Mikroliter Isolationscocktail in die Probe. Gut mischen und 7,5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie nun 50 Mikroliter pro Milliliter Depletion-Cocktail hinzu.
Gut mischen und 2,5 Minuten inkubieren. In der Zwischenzeit die magnetischen Kügelchen wirbeln, um eine gleichmäßige Dispersion zu gewährleisten. Geben Sie 75 Mikroliter der magnetischen Kügelchen in die Probe.
Gut mischen und 2,5 Minuten inkubieren. Füllen Sie die Probe mit RPMI 1640 Medium auf ein Endvolumen von 2,5 Millilitern auf und mischen Sie mehrmals. Setzen Sie dann das Rohr für 2,5 Minuten in den Magneten ein.
Nehmen Sie den Magneten auf und drehen Sie ihn mit dem Röhrchen in einer kontinuierlichen Bewegung um, indem Sie die angereicherte Zellsuspension in ein neues Röhrchen gießen. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Durchführung einer durchflusszytometrischen Analyse auf naive Zöliakie-vier positive T-Zellen vor und nach der Isolierung.
Übertragen Sie die Zellsuspension nach dem Anschnitt in ein neues Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 400 G und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 bis 500 Mikrolitern RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS.
Für jeden Milliliter Zellkultur zwei Mikroliter Leukozytenaktivierungscocktail hinzufügen und mischen. Kultivieren Sie die Zellen in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und gesättigter Luftfeuchtigkeit für vier bis sechs Stunden.
