In vitro Induktion von pathogenen Th17-Zellen in naive CD4⁺ T-Zellen von Mäusen

Entfernen Sie zunächst das PBS von der vorbeschichteten 24-Well-Platte. Resuspendieren Sie die angereicherten Milz-naiven CD4+T-Zellen der Maus in Th17-Zellkulturmedium und geben Sie sie in verschiedene Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die mit Anti-CD3 vorbeschichtet ist. Geben Sie Th0-Zellkulturmedium, klassisches nicht-pathogenes Th17-Kulturmedium und klassisches pathogenes Th17-Kulturmedium zum Kontrastieren in die verbleibenden Vertiefungen der Platte.

Geben Sie einen Mikroliter Anti-CD28-Lösung in jede Vertiefung. Kultivieren Sie die Zellen fünf Tage lang in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie am zweiten Tag die Hälfte des Überstandsmediums der Zellkultur durch frisches Kulturmedium.

Beobachten Sie die Zellen am fünften Tag unter einem optischen Mikroskop. Sammeln Sie die Zellüberstände aus jeder Gruppe und kryokonservieren Sie sie bei 80 Grad Celsius. Naive CD4+T-Zellen wurden fünf Tage lang mit Th0-Medium und Th17-Differenzierungsmedium kultiviert, was dazu führte, dass T-Zellen in beiden Medien Clusterwachstum zeigten.

Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass 90% der naiven CD4+T-Zellen unter der Stimulation eines neuen Th17-Zellkulturmediums erfolgreich zu pathogenen Th17-Zellen differenzierten.