Platzieren Sie zunächst ein formelles und festes Mausauge auf einem Blatt Wachspapier unter einem Präpariermikroskop. Halten Sie mit einer Mikrozange die Reste des Muskels und des Sehnervs fest. Richten Sie dann das Auge so aus, dass die Hornhaut zur Seite zeigt.
Verwenden Sie nun eine chirurgische Klinge, um einen ein bis zwei Millimeter langen Schnitt hinter und parallel zum Limbus zu machen. Üben Sie mit der Klinge eine Kraft nach unten aus, während Sie das Auge an Ort und Stelle halten, bis sich das vordere Segment vom hinteren Ende trennt. Entsorgen Sie dann den vorderen Augenabschnitt und die Linse.
Den hinteren Augenabschnitt in eine sechs Zentimeter große Schale geben, die mit PBS gefüllt ist. Verwenden Sie einen Mikrospatel, um die Netzhaut herauszuschöpfen, während Sie gleichzeitig den Sehnerv mit einer Mikrozange halten. Um die Netzhaut zu spülen, geben Sie sie in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte, die sechs Vertiefungen enthält, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt sind.
Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Wasser neben der Netzhaut vorsichtig auf und ab zu pipettieren, während Sie das Wasser blasen, um ein sanftes Rühren zu verursachen. Verwenden Sie anschließend eine umgekehrte Glaspipette, um die Netzhaut in die zweite Vertiefung zu übertragen. Um die Netzhaut zu verdauen, übertragen Sie die gespülte Netzhaut in Trypsinlösung in einer 12-Well-Platte mit einer umgekehrten Glaspipette.
Zentrieren Sie eine mit Trypsin getränkte P200-Pipettenspitze auf dem Sehnerv. Pipettieren Sie dann vorsichtig das gesamte Gefäßnetz auf und ab, um das nichtvaskuläre Gewebe zu dissoziieren. Verwenden Sie nun eine in Trypsin vorgespülte Pipette aus umgekehrtem Glas, um das retinale Gefäßsystem in eine Vertiefung zu übertragen, die doppelt destilliertes Wasser in einer Sechs-Well-Platte enthält.
Schwenken Sie die Platte und pipettieren Sie dann das Gefäßsystem mit einer mit Trypsin gespülten Glaspipette auf und ab, um jegliches restliches nichtvaskuläres Gewebe zu entfernen. Übertragen Sie das retinale Gefäßsystem vorsichtig in die Mitte der markierten Region auf einem Objektträger mit geladener Oberflächenmikroskopie. Entfernen Sie dann mit einer P200-Pipette vorsichtig das überschüssige Wasser von einer Kante.
Legen Sie den Objektträger in eine Biosicherheitswerkbank nahe der Vorderseite, damit das Restwasser verdunsten kann. Wenn das Gefäßsystem fast trocken ist, übertragen Sie es unter ein Phasenkontrastmikroskop. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um langsam doppelt destilliertes Wasser auf eine Seite des markierten Bereichs zu geben, um das Gefäßsystem vorsichtig zu rehydrieren.
Durch die Fixierung des isolierten retinalen Gefäßsystems entstand strukturell robustes und ausreichend haltbares Gewebe, das für AFM-Messungen geeignet ist. Im Gegensatz dazu wurden die retinalen Gefäße, die von nicht fixierten oder kurz fixierten Augen isoliert wurden, fragmentiert und kollabierten.
