Spülen Sie zunächst mit Glutaraldehyd vernetzte, mit Gelatine überzogene Deckgläser in PBS, die Kalzium-Magnesium enthalten, etwa fünfmal auf einem Orbitalschüttler. Heben Sie während der ersten drei Spülgänge die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette an, um das Glutaraldehyd gründlich abzuspülen. Ersetzen Sie anschließend das Nährmedium von Maus-RECs durch frisches Medium, das mit steriler, gefilterter Ascorbinsäure ergänzt wird.
Spülen Sie die Zellen nach 15 Tagen Behandlung mit kalzium-magnesiumfreiem PBS. Inkubieren Sie die Zellen zwei bis drei Minuten lang in 250 Mikrolitern warmem Dezellularisierungspuffer. Bestätigen Sie die Dezellularisierung der Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop.
Pipettieren Sie den Puffer vorsichtig heraus, ohne die REC-sekretierte subendotheliale Matrix zu stören. Geben Sie dann 0,5 Milliliter PBS in jede Vertiefung. Nach dem Entfernen des PBS fügen Sie 200 Mikroliter RNase freies DNase one hinzu.
Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um alle Zelltrümmer zu entfernen. Betrachten Sie als Nächstes die makroskalige fibröse subendotheliale Matrix unter einem Phasenkontrastmikroskop. Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop, um die feineren nanoskaligen Matrixfasern bei 100-facher Vergrößerung zu betrachten.
Subendotheliale Matrixaggregate wurden auf den Deckgläsern nach Dezellularisierung von 10-Tage- oder 15-Tage-Kulturen von Human- oder Maus-RECs beobachtet. Die konfokale Mikroskopie der dezellularisierten Matrizen zeigte eine dichte nanofibrilläre Kollagen-IV- und Fibronektin-Matrix.
