Präparation und Sortierung von CT-FR-gefärbten Zebrafisch-T-ALL-Zellen für die Transplantation und Tumorverfolgung

Für die Vorbereitung der Spenderplatte werden 500.000 Wildtyp-CG1-Zebrafischzellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie fünf Milliliter Fischmedium hinzu, um die Zellbrühe auf 100 Zellen pro Mikroliter zu verdünnen. Geben Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und stellen Sie die Platte bis zur Sortierung bei vier Grad Celsius auf.

Bereiten Sie Flecken- und Einfarbkontrollen für den Aufbau des Sortierexperiments vor. Führen Sie die Zellsuspension der Kontrollen und der Proben durch eine 35-Mikron-Filterkappe in ein Faxrohr auf Eis. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 2.500 g bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie vorsichtig 45 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung und lassen Sie fünf Mikroliter Flüssigkeit zurück. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer 20-Mikroliter-Pipette und injizieren Sie die Zellsuspensionen mit der Hamilton-Mikrospritze in die gewünschte Anzahl von CG1-Zebrafischen. Nach der Transplantation von CG1-Zebrafischen mit sortierten Zellen für die limitierende Verdünnungsanalyse wiesen die CT-FR-Hochzellen eine vierfach höhere leukämische Stammzellfrequenz im Vergleich zu CT-FR-Niederzellen auf.

Repräsentative Bilder von Zebrafischen 28 Tage nach der Transplantation zeigten, dass 89 % der Zebrafische mit hohem CT-FR-Gehalt Leukämie entwickeln, verglichen mit 20 % in der Gruppe mit niedrigem Zebrafisch. CT-FR hohe Zebrafische hatten eine signifikant kürzere Latenzzeit bis hin zu Leukämie. CT-FR hohe Zebrafische hatten ein signifikant geringeres Gesamtüberleben im Vergleich zu den CT-FR niedrigen Zebrafischen.