Legen Sie zunächst ein Fläschchen mit kryokonservierten mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut des Menschen in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Nach dem Auftauen wird die PBMC-Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit neun Millilitern TGM überführt. Das Röhrchen wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, nachdem ein Aliquot der Zellsuspension zur Zählung herauspipettiert wurde.
Resuspendieren Sie das pelletierte PBMC in drei Millilitern TGM. Übertragen Sie dann das erforderliche Volumen der Zellsuspension in eine Sechs-Well-Platte. Am Tag vor der Zellwiederbelebung werden 100 Mikroliter Immunglobulin G-Magnetkügelchen der Maus in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Geben Sie einen Milliliter PBS in die Röhrchen und legen Sie sie auf einen Magnetständer, um die Kügelchen zu waschen. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern PBS. Geben Sie dann die Antikörper in die Suspension.
Verwenden Sie eine Pipette, um die Suspension vorsichtig gut zu mischen. Platzieren Sie die Federung über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe. Nachdem Sie die Kügelchen wie zuvor in PBS gewaschen haben, suspendieren Sie sie wieder in 100 Mikrolitern PBS.
Geben Sie nun NHCD3 hCD28-beschichtete Immunkügelchen auf die Platte und inkubieren Sie. Nach 48 Stunden Inkubation wird die Zellsuspension gemischt und in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Legen Sie die Röhre für drei Minuten auf einen Magnetständer.
Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Säen Sie fünfmal 10 hoch fünf PBMC in 300 Mikrolitern TGM in die Vertiefungen einer 48-Well-Flachplatte. Pipettieren Sie 200 Mikroliter lentiviralen Stamm in die entsprechenden Vertiefungen.
Geben Sie dann Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu, bevor Sie zentrifugieren. Pipettieren Sie 300 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung heraus und geben Sie dann einen Milliliter frisches TGM in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid.
Geben Sie alle zwei bis drei Tage frische 0,5 bis zwei Milliliter TGM auf den Teller. Übertragen Sie dann die Zellen in eine 12-Well-Platte, gefolgt von einer Sechs-Well-Platte, bis die Gesamtzelldichte 6 Millionen in einem Volumen von vier Millilitern erreicht.
