Zu Beginn werden die kultivierten CAR-transduzierten T-Zellen in zwei 12-Well-Platten mit zwei Millilitern TGM plattiert. Stellen Sie eine Platte direkt in einen befeuchteten Inkubator unter 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Legen Sie die andere Platte in eine mobile Kohlendioxid-Sauerstoff-Stickstoff-Inkubatorkammer mit einem auf 1 % voreingestellten SauerstoffgehaltSammeln Sie alle 24 Stunden unter beiden Bedingungen 500.000 Zellen von den Platten in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Die Röhrchen werden fünf Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, pipettieren Sie vorsichtig einen Milliliter PBS in das Zellpellet. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 50 Mikrolitern FACS-Puffer.
Fügen Sie dann 50 Mikroliter einer Verdünnung von 1 bis 100 Uhr des Phycoerythrin-konjugierten Anti-Flag-Antikörpers hinzu. Pipettieren Sie die Suspension, um sie gründlich zu vermischen. Geben Sie nach der Inkubation einen Milliliter FACS-Puffer in jedes Röhrchen.
Die gemischte Suspension wird fünf Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Pipettieren Sie nun die Überstände aus jedem Röhrchen heraus. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern FACS-Puffer.
Die resultierende Zellsuspension wird in fünf Milliliter Durchflusszytometrie-Röhrchen überführt. Führen Sie eine Durchflusszytometrie an der Zellsuspension durch, um die Expression des oberflächenchimären Antigenrezeptors zu bestimmen. Richten Sie neue Rohre als Rohling und CAR ein.
Klicken Sie auf FSCA-, FSCH-, SSCA-, SSCH-, PE- und FITC-Kanal. Erstellen Sie dann vier Streudiagramme, um nacheinander einzelne Zellen, lebende Zellen, GFP-positive und PE-positive Zellen zu identifizieren. Legen Sie die Parameter für die Entnahme von 10.000 einzelnen lebenden Zellen fest.
Klicken Sie auf Daten erfassen. Nachdem die Zellensammlung stabil ist, klicken Sie auf Daten aufzeichnen. Um die Position der Gates gemäß der Negativkontrolle zu bestimmen, gaten Sie die Zellen, die positiv für EGFP und Phycoerythrin sind, um die Phycoerythrin-Positivität und die mediane Fluoreszenzintensität zu messen.
Die Hypoxie-Sensitivität pro zwei Targeting-CAR zeigte signifikant hohe Expressionen von CAR unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu normoxischen Bedingungen.
