Zu Beginn säen Sie 1000 Zielzellen in jede Vertiefung von zwei 96-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden, die 200 Mikroliter FBSDMEM enthalten. Pipettieren Sie am nächsten Tag vorsichtig 100 Mikroliter des Überstands aus der Oberseite jeder Vertiefung heraus. Fügen Sie chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen oder nicht transduzierte T-Zellen in 100 Mikrolitern FBSDMEM in unterschiedlichen Verhältnissen hinzu.
Stellen Sie eine Platte in eine Atmosphäre mit 21 % Sauerstoff und die andere in eine mobile Kohlendioxid-Sauerstoff-Stickstoff-Inkubatorkammer unter einer Atmosphäre mit 1 % Sauerstoff. Nach 24 Stunden Co-Kultivierung verwenden Sie eine Pipette, um den gesamten Überstand vorsichtig in eine neue 96-Well-Platte mit U-Boden zu übertragen. Lagern Sie den Überstand bei minus 20 Grad Celsius für den Zytokinnachweis.
Geben Sie nun 60 Mikroliter passiven Lysepuffer in jede Versuchsvertiefung der schwarzen 96-Well-Platten mit flachem Boden. Legen Sie die Platten für 30 Minuten auf einen Schüttler, um eine effiziente Zelllyse zu gewährleisten. Geben Sie 60 Mikroliter Glühwürmchen-Luciferase-Substrat in jede Versuchsvertiefung.
Verwenden Sie einen Mikroplatten-Reader, um die Luciferase-Aktivität sofort zu messen. Berechnen Sie abschließend den normalisierten Prozentsatz der Zytotoxizität mit der angegebenen Gleichung. Das Hypoxie-empfindliche HER2-Targeting-CAR war in der Lage, Zielzellen effektiv abzutöten, unabhängig davon, ob die Atmosphäre hypoxisch oder normoxisch war.
Im Gegensatz dazu zeigten die HER2-BBz-ODD CAR-T-Zellen unter normoxischen Bedingungen für alle Bedingungen eine signifikant schwächere Zytotoxizität.
