Entnehmen Sie zunächst eine in Paraffin eingebettete Scheibe von Lungengewebe der Maus und legen Sie sie für 60 Minuten in einen 65 Grad Celsius heißen Ofen. Tauchen Sie zum Färben den Objektträger mit dem Gewebeschnitt nacheinander in die Färbegefäße mit den entsprechenden Lösungen. Verdünnen Sie die modifizierte Natriumcitrat-Antigen-Rückgewinnungslösung 50-fach mit deionisiertem Wasser.
Nachdem Sie den Antigenextrakt in der Mikrowelle bei hoher Leistung vorgeheizt haben, legen Sie den Objektträger 15 Minuten lang zum Kochen hinein. Nachdem die Folie auf Raumtemperatur abgekühlt ist, waschen Sie sie zweimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Permeabilisieren Sie dann das Gewebe zweimal für jeweils 10 Minuten mit 0,25% Triton.
Umkreisen Sie das Gewebe mit einem immunhistochemischen Stift und inkubieren Sie den Objektträger mit 5 % BSA bei Raumtemperatur für eine Stunde. Als nächstes verdünnen Sie das Isolektin B4 oder IB4 mit 1% BSA in einem Verhältnis von 1 zu 50. Nach dem Entfernen des überschüssigen Wassers wird der Gewebeschnitt über Nacht mit 50 bis 100 Mikrolitern des verdünnten IB4 bei vier Grad Celsius inkubiert.
Waschen Sie die Objektträger dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS und permeabilisieren Sie sie 10 Minuten lang mit 0,25 % Triton. Anschließend wird der Gewebeschnitt mit 50 bis 100 Mikrolitern DAPI bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubiert. Tragen Sie nach drei PBS-Wäschen einen Tropfen Anti-Fade-Eindeckmittel auf den Objektträger auf und vermeiden Sie dabei Lichteinwirkung.
Montieren Sie den luftgetrockneten Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop, um Bilder des Zellkerns und der Zielsignale aufzunehmen. Dieses Protokoll ermöglicht die präzise Lokalisierung und Beobachtung der pulmonalen Mikrovaskulatur mit IB4 zur Färbung von Mikroendothelzellen in verschiedenen Lungenlappen der Maus unter einem Fluoreszenzmikroskop.
