Entnehmen Sie zunächst Isolectin B4- oder IB4- und DAPI-gefärbte Lungengewebeschnitte von Mäusen. Nehmen Sie Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 10-fach-Objektiv auf. Importieren Sie die Bilder in die ImageJ-Software und wählen Sie sie aus.
Teilen Sie die Kanäle entsprechend auf und laden Sie die Datei im ND2-Format für DAPI- und IB4-Kanäle. Navigieren Sie zu Analysieren, Skalierung festlegen. Konfigurieren Sie die Bildparameter, und wählen Sie dann Global aus, gefolgt von OK.To gleichen Anzeigebereich festlegen, wechseln Sie zu Bild, passen Sie den Helligkeitskontrast an, und klicken Sie auf Festlegen.
Legen Sie den Anzeigebereich für IB4 auf null bis 10.000 und den für DAPI auf null bis 20.000 fest. Um den Hintergrund zu entfernen, klicken Sie auf Verarbeiten, gefolgt von Mathematik. Subtrahieren Sie das Hintergrundsignal basierend auf den Werten, die vom Zauberstab im Hintergrund erkannt wurden.
Um den besten Schwellenwert auszuwählen, gehen Sie zu Bild und klicken Sie auf Duplizieren. Wählen Sie sowohl den Original- als auch den Bilddupliziertyp auf 8-Bit aus. Wählen Sie anschließend auf der Registerkarte Bild die Option Anpassen aus, gefolgt von Schwellenwert und Eingabemodi.
Nachdem Sie den realistischsten Schwellenwert ausgewählt haben, wählen Sie Dunkler Hintergrund und wenden Sie ihn an. Wählen Sie mit dem Zauberstab größere Blutgefäße im Vergleich zum duplizierten Bild aus und klicken Sie dann auf Löschen, um IB4-positive Signale von großen Arterien und Venen zu eliminieren. Um die Anzahl der Zielsignale zu zählen, klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Messungen festlegen und markieren Sie Bereich, Auf Schwellenwert begrenzen und Beschriftung anzeigen.
Wählen Sie dann "Partikel analysieren" und ändern Sie "Größe" von null bis unendlich, "Kreisförmigkeit" von null bis eins und "Als Überlagerungsmasken anzeigen". Aktivieren Sie Zusammenfassen und klicken Sie auf OK. Wählen Sie abschließend Zusammenfassung aus. Klicken Sie auf Datei und speichern Sie die Ergebnisse.
Der prozentuale Anteil der IB4-positiven Herde im kranialen, mittleren, kaudalen, akzessorischen und linken Lungenlappen konnte zwischen den jungen und mittleren Mäusen mit Hilfe der ImageJ-Analyse unterschieden werden.
