Ersetzen Sie nach der Kalibrierung des Respirometriesystems MiR05 aus jeder Kammer durch frische 2,1 Milliliter MiR05-Lösung. Geben Sie in der Respirometrie-Software die Instrumenteneinstellungen ein. Legen Sie den Dateinamen fest und speichern Sie die Einstellungen.
Geben Sie im nächsten Dialogfeld die Probeninformationen ein, einschließlich des Gewichts jeder Probe, die jeder Kammer hinzugefügt wurde. Öffnen Sie nun das Fenster für die Sauerstoffkalibrierung, klicken Sie auf Aus Datei kopieren und wählen Sie die gespeicherte Luftkalibrierungsdatei aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren.
Übertragen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig Muskelfaserbündel, die zuvor aus der Maus isoliert wurden, in die Beatmungslösung. Setze die Stopfen auf die Kammer und schiebe sie etwa zur Hälfte nach unten, um die Kammer halb zu schließen. Sobald die O-Ringe an den Stopfen in die Kammerwand einrasten, führen Sie eine Drehbewegung aus, während Sie sie nach unten drücken, um sie zu schließen.
Wenn die Kammer halb geschlossen ist, wird eine kleine Luftblase am oberen Rand der Kammer beobachtet. Füllen Sie eine 10-Milliliter-Plastikspritze mit reinem Sauerstoff aus einem Sauerstofftank. Legen Sie die lange, stumpfe Nadel auf die Spritze, führen Sie die Nadel in die erste Kammer ein und geben Sie langsam etwa einen Milliliter Sauerstoff ab.
Überwachen Sie die Sauerstoffkonzentration in der Kammer. Wenn die Konzentration 350 bis 400 Nanomol pro Milliliter erreicht, drehen Sie den Stopfen vorsichtig, während Sie ihn nach unten drücken, um die Kammer vollständig zu schließen. Beobachten Sie die Kammer und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zurückbleiben.
Um die Daten des Sauerstoffflusses auf die Gewebemasse aus dem Layout-Menü zu normalisieren, wählen Sie das Layout 06 spezifischer Fluss pro Probeneinheit. Stellen Sie sicher, dass sich die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstofffluss nach der Sauerstoffzugabe stabilisiert haben, um mit der Atmungsmessung zu beginnen. Geben Sie mit einer 10-Mikroliter-Glasspritze 2,5 Mikroliter 0,8 molares Malat in jede Kammer.
Drücken Sie F4, um die Zeitleiste zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit M.Record stable oxygen flux für ein bis zwei Minuten. Für aerobe Glykolytika geben Sie 10 Mikroliter zweimolares Glutamat und fünf Mikroliter zwei molare Pyruvate in jede Kammer. Drücken Sie F4, um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit GP. Zeichnen Sie einen stabilen Sauerstofffluss für ein bis zwei Minuten auf.
Geben Sie 10 Mikroliter 2 molare Glutamate und 10 Mikroliter 10 millimolare Palmitoylcarnitin in jede Kammer für Fettsäuresubstrate. Drücken Sie F4, um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit GPC. Zeichnen Sie einen stabilen Sauerstofffluss für ein bis zwei Minuten auf.
Geben Sie mit einer 25-Mikroliter-Glasspritze 20 Mikroliter 0,5 molare ADP in jede Kammer. Drücken Sie F4, um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit ADP. Zeichnen Sie einen stabilen Sauerstofffluss für ein bis zwei Minuten auf.
Geben Sie nun 20 Mikroliter eines molaren Succinats in jede Kammer. Drücken Sie F4, um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit S.Record stable oxygen flux für ein bis zwei Minuten. Geben Sie mit einer 10-Mikroliter-Glasspritze fünf Mikroliter vier Millimolare Cytochrom c in jede Kammer.
Drücken Sie F4, um die Zeitachse zu markieren, und beschriften Sie die Markierung mit Cytochrom c. Zeichnen Sie einen stabilen Sauerstofffluss für ein bis zwei Minuten auf. Titrieren Sie in 3 Ein-Mikroliter-Boli von einem Millimolar FCCP mit einer 10-Mikroliter-Glasspritze.
Die FCCP-Ausgabe führt zu einer kurzzeitigen Abnahme des Sauerstoffflusses. Warten Sie, bis der Sauerstofffluss zunimmt und sich stabilisiert, bevor Sie aufnehmen. Drücken Sie F4, um die Zeitachse zu markieren, und markieren Sie sie mit FCCP.
Zeichnen Sie einen stabilen Sauerstofffluss für ein bis zwei Minuten auf. Sobald der Test abgeschlossen ist, drehen Sie den Stopfen vorsichtig und ziehen Sie ihn nach oben, um ihn zu entfernen. Spülen Sie die Kammer dreimal mit Reinstwasser, gefolgt von dreimal mit 70 % Ethanol.
Platzieren Sie die Stopfen in den Kammern, bis ein Widerstand zu spüren ist, aber schließen Sie sie nicht vollständig. Verschließen Sie dann die Stopper. Speichern Sie die Assay-Datei und trennen Sie das Gerät von der Software.
Schalten Sie abschließend das Respirometer aus. In ordnungsgemäß vorbereiteten murinen Proben hatte die Zugabe von Cytochrom c nach ADP keinen Einfluss auf den Sauerstofffluss, was die Integrität der äußeren Mitochondrienmembran bestätigt. Wenn Gewebeproben jedoch nicht richtig vorbereitet wurden, führte die Zugabe von Cytochrom c nach ADP zu einem Anstieg des Sauerstoffflusses um 40 %, was auf eine Schädigung der äußeren Mitochondrienmembran hinweist.
