Um Salmonellenkulturen mit Bakterienphagen zu infizieren, verdünnen Sie eine Übernachtkultur von Salmonella enterica in einem Endvolumen von fünf Millilitern LB und fügen Sie 0,1 Milliliter zuvor hergestelltes Bakterien-Phagenlysat hinzu. Dann bei 37 Grad Celsius und 200 U/min 24 Stunden lang inkubieren. In einem konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen verdünnen Sie die Bakterienkultur, die Phagen enthält, 100-mal in fünf Millilitern 0,22 Mikrometer gefiltertem LB. Die Suspension wird 10 Minuten lang bei 2.377 g zentrifugiert.
Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie am Boden etwas Volumen, um das Vorhandensein von Zellen sicherzustellen. Waschen Sie die Bakterienzellen mit 10 Millilitern 0,22 Mikrometer gefiltertem LB-Medium. Nach dreimaliger Wiederholung der Zentrifugation und dreimaligem Waschen resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern des filtrierten LB. Verwenden Sie ein Vakuumfiltrationssystem, um 50 Mikroliter der erhaltenen Bakteriensuspension durch einen sterilen 0,45-Mikron-Filter zu filtrieren.
Spülen Sie den Filter mit 100 Millilitern des gefilterten LB.To erleichtern Sie die Phagenfreisetzung aus Bakterienzellen, inkubieren Sie den Filter mit den Zellen, ohne das System zu zerlegen. Spülen Sie den Filter erneut, wie zuvor gezeigt, mit dem Vakuumfiltersystem. Um die Bakterienzellen mit einer sterilen Pinzette aus dem Filter zu gewinnen, wird der Filter in einen Kolben umgefüllt.
Geben Sie dann zwei Milliliter 2x LB über den Filter und pipettieren Sie mehrmals, um die Zellen aus dem Filter zu lösen. Zentrifugieren Sie einen Milliliter dieser Suspension für zwei Minuten bei 10.354 g. Nach dem Entsorgen des Überstands werden die Zellen dreimal mit einem Milliliter filtriertem LB-Medium gewaschen.
Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter von 2x LB. Mischen Sie als nächstes handelsübliches Salmonella enterica Lipopolysaccharid oder LPS mit 20 Mikrolitern der bakteriellen Suspension in einem Milliliter gefiltertem LB. Inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 200 U/min, um eine erneute Infektion mit Bakterienphagen zu verhindern. Übertragen Sie danach einen Milliliter Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Suspension zwei Minuten lang bei 10.354 g. Waschen Sie das Pellet dreimal mit einem Milliliter gefiltertem LB-Medium.
Nach dem Waschen resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 2x LB. Fügen Sie 20 Mikroliter dieser Mischung zu einem Milliliter gefiltertem LB hinzu, das 0,8 Milligramm pro Milliliter kommerzielles LPS enthält. Und inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius und 200 U/min zwei Stunden lang. Als nächstes pelletieren Sie einen Milliliter Kultur in einem Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie zwei Minuten lang bei 10.354 g zentrifugieren.
Nachdem Sie die Zellen dreimal mit gefiltertem LB gewaschen haben, suspendieren Sie sie in einem Milliliter gefiltertem LB. Mit einem Vakuumfiltrationssystem wird ein Milliliter Bakteriensuspension durch einen sterilen 0,45-Mikron-Filter geleitet und der Filter mit 100 Millilitern gefiltertem LB gespült. Den Filter mit einer sterilen Pinzette in einen Kolben umfüllen. Geben Sie zwei Milliliter 2x LB über den Filter und pipettieren Sie mehrmals, um Zellen aus dem Filter zu lösen. Zentrifugieren Sie einen Milliliter Zellen zwei Minuten lang bei 10.354 g, bevor Sie ihn dreimal mit gefiltertem LB waschen. Resuspendieren Sie die gesammelten Zellen in einem Milliliter von 2x LB.To bereiten Sie das Phagenfreie Inokulum vor, fügen Sie 100 Mikroliter Zellen aus der Bakteriensuspension zu 900 Mikrolitern LB hinzu, die 0,45 Milligramm pro Milliliter LPS enthalten.
Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie bei 200 U/min. Verwenden Sie dies als Aliquot, um das Fehlen einer Phagen-Reinfektion zu bestätigen. Durch die Durchführung von Titrationen in verschiedenen Stadien des Protokolls wurde beobachtet, dass wiederholtes Waschen und Filtern nicht ausreichten, um Bakterienphagen aus Kulturen zu eliminieren.
Die Anzahl der Phagen nahm jedoch ab, sobald ein Inkubationsschritt mit kommerziellem LPS durchgeführt wurde. Der entscheidende Schritt für die vollständige Entfernung von Bakterienphagen in der Bakterienkultur war die zweite Inkubation mit kommerziellem LPS.
