Zu Beginn 3 mal 10 hoch 6MCA205 Fibrosarkomzellen in 10 Milliliter vollständiges Wachstumsmedium in einer 100 Millimeter Petrischale plättieren. Bestrahlen Sie die Zellen mit ultraviolettem Licht und inkubieren Sie sie mindestens sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um sie sterben zu lassen. Waschen Sie in vitro differenzierte dendritische Zellen (DCs) zweimal bei 1100 g für vier Minuten in einem vollständigen Wachstumsmedium.
Zählen Sie die aus dem Knochenmark gewonnenen leeren DCs mit dem Trypanblau-Farbstoffausschlusstest. Zentrifugieren Sie die bestrahlten Krebszellen fünf Minuten lang bei 1100 G. Setzen Sie die Co-Kultur von leeren DCs mit bestrahlten apoptotischen Zellen in einer 12-Well-Platte für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid im Verhältnis zwei zu eins ein.
Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal bei 1100 g für fünf Minuten in 10 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium in 15-Milliliter-Röhrchen. Für die Färbung der Zelloberfläche werden die aus dem Knochenmark gewonnenen DCs in 20 Mikrolitern kaltem FACS-Puffer resuspendiert und 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert. Nachdem Sie die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen haben, fügen Sie 30 Minuten lang 100 Mikroliter PBS hinzu, das einen vitalitätsfixierbaren Nahinfrarotfarbstoff enthält.
Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, bevor Sie sie wieder im FACS-Puffer suspendieren. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen anhand ihrer FSCA- und SSCA-Eigenschaften. Plotten Sie dann FSCA und FSCH, um Zelldubletten und Klumpen von der Analyse auszuschließen.
Diagramm von 780 bis 60 Nanometern Emissionsbandpass, Filterfläche und SSCA zur Entfernung abgestorbener Zellen. Mit 575 bis 26 und 530 bis 30 Nanometern Emissions-Bandpassfiltern können Sie die Zellpositivität für CD11C-Marker und PKH67-Fluoreszenzzelllinker in zwei Parameterdichtediagrammen nachweisen. Nach der Zählung kultivieren Sie die CD8-T-Zellen mit aus dem Knochenmark gewonnenen DCs, die apoptotische MCA205-Zellen in einem Verhältnis von zwei zu fünf zu eins bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 72 Stunden aufgenommen hatten.
Geben Sie EdU in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren in das Co-Kulturmedium und inkubieren Sie es 16 bis 20 Stunden lang. Zentrifugieren Sie das CD8, flüstern Sie es zweimal bei 1100 g für fünf Minuten und färben Sie es 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln in kaltem FACS-Puffer auf Oberflächenmarker. Nachdem Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer gewaschen haben, suspendieren Sie sie 30 Minuten lang in 100 Mikrolitern PBS, die den vitalitätsfixierbaren Aquafarbstoff enthalten.
Waschen Sie die Zellsuspensionen einmal mit drei Millilitern 1%BSA in PBS in Durchflussschläuchen. Fügen Sie 100 Mikroliter 4%-Paraformaldehyd für 15 Minuten zur Zellfixierung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang in 100 Mikrolitern Permeabilisierungs- und Waschreagenz auf Saponinbasis.
500 Mikroliter des Reaktionscocktails zugeben und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Permeabilisierungs- und Waschreagenz auf Saponinbasis. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen basierend auf ihren FSEA- und SSEA-Eigenschaften.
Plotten Sie dann FSEA und FSEH, um Zelldubletten und -klumpen von der Analyse auszuschließen. Plotten Sie 525 bis 50 Nanometer Emissions-Bandpass-Filterfläche und SSCA, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Unter Verwendung von 530 bis 30 und 575 bis 26 Nanometern Emissions-Bandpass-Filterdichtediagrammen können Sie die Positivität der Zellen für CD8a und CD3 ermitteln.
Analysieren Sie Zellen auf den Einbau von Alexa Fluor 647 EdU in einem Einzelparameter-Histogramm mit einem Bandpass-Emissionsfilter von 660 bis 620 Nanometern. CD11c-positive dendritische Zellen verschlangen apoptotische MCA205-Krebszellen effektiv bei 37 Grad Celsius, was eine temperaturabhängige Phagozytose in frühen Stadien des Krebsimmunitätszyklus zeigt. Nach der Phagozytose zeigten dendritische Zellen erhöhte CD86- und MHC-II-Spiegel zusammen mit reduzierten PDL1-Spiegeln.
Die klonale Expansion von CD8-positiven T-Zellen nach der Aktivierung durch reife dendritische Zellen war mit einer Proliferationsrate von etwa 20% offensichtlich. Mit Hilfe von Tumor-on-Chip-Modellen konnte die chemotaktische Reaktion dieser T-Zellen auf die von Krebszellen freigesetzten Alarmine beobachtet werden.
