Nachdem Sie CD8 aus der Kokultur zurückgewonnen haben, zentrifugieren Sie sie bei 1100 g für 10 Minuten in 10 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium. Resuspendieren Sie 1 x 10 hoch 7 Zellen in 100 Mikrolitern Mikrokügelchen zur Entfernung abgestorbener Zellen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Setzen Sie Trennsäulen in den Magnetabscheider ein und spülen Sie sie mit Bindepuffer aus.
Übertragen Sie die Zellsuspensionen in Trennsäulen und sammeln Sie den Durchfluss. Sammeln Sie nach dem Waschen der Säule die unmarkierten Zellen, die den Durchgang durchlaufen, und kombinieren Sie sie mit den zuvor gesammelten Durchflusszellen. Mit CD8 angereichertes lebendes CD8 fünf Minuten lang bei 1100 g in einem vollständigen Wachstumsmedium zentrifugieren.
Nach der Zählung werden CD8-Zellen mit frischen MCA205-Zellen im Verhältnis zwei zu eins in 12-Well-Platten gekitzelt und 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Vor der Wiederherstellung des CD8-Effektors fügen Sie Monensin und Brefeldin sechs Stunden lang zu den Kokulturen der Krebsimmunzellen hinzu. Dann den CD8-Effektor zurückgewinnen und zweimal bei 1100 g für fünf Minuten zentrifugieren.
Resuspendieren Sie die Zellen in drei verschiedenen primären Antikörpermischungen, die in kaltem FACS-Puffer hergestellt wurden, und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um sie vor Licht zu schützen. Geben Sie 100 Mikroliter Fixierlösung aus Mix C in den Zellgaumen und inkubieren Sie 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Die Zellen werden in einem Kaltwaschpuffer resuspendiert und 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.
Nachdem Sie die Zellen zweimal in FACS-Puffer gewaschen haben, fügen Sie den Zellpellets 30 Minuten lang 100 Mikroliter PBS mit dem Vitality Fixable Aqua Dye hinzu. Identifizieren Sie interessante Zellen basierend auf ihren FSCA- und SSCA-Eigenschaften. Plotten Sie dann FSCA und FSCH, um Zelldubletten und Klumpen von der Analyse auszuschließen.
525/50-Nanometer-Emissions-Bandpassfilter und SSCA zur Entfernung abgestorbener Zellen plotten. Mit 660/20- und 780/60-Nanometer-Emissionsbandpassfiltern wird die Zellpositivität für CDAA und CD3 in zwei Parameterdichtediagrammen nachgewiesen. Des Weiteren werden Zellen auf CD44-, CD25- und CD69-Marker für CD137-Marker und auf Interferon-Gamma-positiv und Granzym B für Mix A, B bzw. C analysiert. Für den Tumorabtötungsassay ist das Kokulturmedium mit einem Echtzeit-Farbstoff zur Quantifizierung des Zelltods zu ergänzen.
Nachdem Sie die Platte im Lebendzellanalysesystem auf 37 Grad Celsius erwärmt haben, führen Sie bis zu 72 Stunden lang alle zwei Stunden einen Datenscan durch. Zentrifugieren Sie die Zellen zweimal bei 1000 g für fünf Minuten. Färbezellen für Oberflächenmarker mit 20 Mikrolitern kaltem FACS-Puffer und inkubieren Sie 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Fügen Sie dann den Vitalitätsfarbstoff Propidiumiodid hinzu, um die Zellen für eine Gating-Strategie zu färben. Identifizieren Sie die interessierenden Zellen anhand ihrer FSCA- und SSCA-Eigenschaften. Plotten Sie dann FSCA und FSCH, um Zelldubletten und Klumpen von der Analyse auszuschließen.
Verwenden Sie einen 450/50-Nanometer-Emissionsbandpassfilter, um Krebszellen zu erkennen, die negativ auf CD45 sind. Analysieren Sie die Zellen in einem Einzelparameter-Histogramm unter Verwendung eines 610/620-Nanometer-Bandpass-Emissionsfilters auf den Einbau von Propidiumiodid als mittlere Fluoreszenzintensität. Durch Multiparameter-Durchflusszytometrie wurden die Oberflächenexpressionsniveaus des frühen Aktivierungsmarkers CD69, der späten Aktivierungsmarker CD44 und CD25, der Membranexpression von CD137 und CD107 und der Tumorreaktivitätsmarker erhöht.
Die intrazellulären Spiegel von zytotoxischen Molekülen, Granzym B und Interferon gamma-positiv wurden progressiv und signifikant erhöht und erreichten einen Expressionshöhepunkt nach 72 Stunden Kokultur. Verwandte kokultivierte MCA205-Zellen erlitten ein signifikantes Maß an CD8-Effektor-vermitteltem Tod.
