Fixierung und Blockade von 2D-Kulturen humaner Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) für die immunhistochemische Analyse

Geben Sie zunächst 30 Milliliter 5%iges Kaliumhydroxid in Methanol in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie 100 Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 Millimetern in der Tube für 30 Minuten unter ständigem Rühren. Waschen Sie anschließend die Eindeckeinlagen 30 Minuten lang in demineralisiertem Wasser.

Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, geben Sie die Einbezugsbänder zur Aufbewahrung in 70%ige Isopropyllösung. Um die Deckgläser zu beschichten, lehnen Sie diese zunächst einzeln an die Wand einer quadratischen Petrischale. Wenn der Isopropylalkohol verdampft ist, geben Sie sie in eine 24-Well-Platte.

Pipettieren Sie einen Milliliter Kollagen in PBS in jede Vertiefung und inkubieren Sie. Waschen Sie anschließend die Eindeckeinlagen etwa 4 bis 5 Mal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter PBS. Pipettieren Sie kultivierte HUVECs in die Vertiefungen mit den beschichteten Deckfolien.

Nachdem Sie die Zellen für eine gewünschte Zeit kultiviert haben, waschen Sie die Zellen fünf Minuten lang in einem Milliliter PBS. Fixieren Sie die Zellen in einem Milliliter 2%Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie nun die Zellen in einem Milliliter PBS für 3 bis 4 Waschgänge von jeweils fünf Minuten.

Pipettieren Sie abschließend einen Milliliter Blockierungspuffer in die Well-Platte, bevor Sie färben.