Geben Sie zunächst HUVECs in ein 10-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das acht Milliliter endotheliales Wachstumsmedium enthält. Geben Sie zwei Milliliter METHOCEL-Stammlösung in das Röhrchen und schütteln Sie es gut. Übertragen Sie anschließend 25 Mikroliter der Mischung auf die umgekehrte Innenfläche einer großen, quadratischen Petrischale.
Drehen Sie den Deckel vorsichtig um 180 Grad und legen Sie ihn auf den Boden eines Zellkulturgefäßes und inkubieren Sie ihn über Nacht. Geben Sie am nächsten Tag 2,3 Milliliter Rattenschwanzkollagen Typ I in ein Fläschchen mit 0,28 Millilitern 10X Medium 199. Diese Mischung auf Eis legen und mixen, bis sie gleichmäßig gelb ist.
Titrieren Sie die Mischung gegen Natriumhydroxid, bis sie orange wird. Fügen Sie dann dem Endprodukt 50 Mikroliter HEPES-Puffer hinzu. Sammeln Sie die hängenden kultivierten Zellen in einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen mit 20 Millilitern PBS und zentrifugieren Sie dann.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie dem Sphäroid-Pellet 0,1 Milliliter FBS und 0,4 Milliliter endotheliales Basalmedium hinzu. Klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um das Pellet wieder aufzuwirbeln. Pipettieren Sie nun zwei Milliliter METHOCEL-Stammlösung und mischen Sie gut.
Fügen Sie dann zwei Milliliter der vorbereiteten Kollagenmischung zu den resuspendierten Sphäroi hinzu. 0,5 Milliliter der resultierenden Mischung in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte geben und inkubieren. Als nächstes pipettieren Sie 100 Mikroliter verdünnten rekombinanten humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor in die Vertiefungen der Platte.
Inkubieren Sie die Zellkultur bei 37 Grad Celsius unter 5%iger Kohlendioxid-Supplementierung für 12 Stunden. Am nächsten Tag nehmen Sie mit einem inversen Mikroskop die Bilder der Sphäroide auf, die nicht mit dem Bohrlochrand in Berührung kommen, miteinander oder zeigen Anzeichen von Beschädigungen. Die Sphäroide, die nur mit basalem Medium oder rekombinantem humanem vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor stimuliert wurden, waren deutlich unterscheidbar.
Sphäroide in minderwertigen Gelen schienen zu Boden zu fallen und sich zu verteilen. Die Negativkontrolle zeigte eine moderate Keimungsrate zu Studienbeginn, während der humane vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor die relative Keimungslänge verdoppelte oder verdreifachte. Die Anzahl der Sprossen zeigte einen ähnlichen Dynamikumfang.
