Immunzytochemie von Sphäroiden aus humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) in einer 3D-Kollagenmatrix zur Untersuchung der Angiogenese in vitro

Zu Beginn fixieren Sie die gekeimten sphäroiden HUVEC-Gele eine Stunde lang in einem Milliliter 4% Paraformaldehyd. Waschen Sie die Gele etwa drei- bis viermal vorsichtig in einem Milliliter PBS. Löse die Gele vollständig von der Oberfläche jeder Vertiefung der Platte und übertrage sie dann in neue 24-Well-Platten.

Geben Sie einen Milliliter Blockierungslösung in die Vertiefungsplatte und inkubieren Sie dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. Pipettieren Sie nach der Inkubation 500 Mikroliter der primären Antikörperlösung vor der Inkubation in die Vertiefungen. Waschen Sie die Gele am nächsten Tag sanft mit PBS für fünf Waschzyklen von jeweils fünf Minuten.

500 Mikroliter des entsprechenden Sekundärantikörpers, verdünnt mit Phalloidin-FITC, in Blockierungspuffer zugeben. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler. Nachdem Sie die Gele in PBS gewaschen haben, übertragen Sie sie auf Objektträger.

Geben Sie zwei Tropfen DAPI-haltiges Eindeckmedium auf einen Deckglas und legen Sie es über jedes Gel. Versiegeln Sie die getrockneten Gele mit Nagellack. Legen Sie sie im Dunkeln und lagern Sie sie bis zur weiteren Analyse bei vier Grad Celsius.