Bereiten Sie zunächst sechs Nematoden-Wachstumsmedien oder NGM-Agarplatten vor. Am nächsten Tag 200 Mikroliter Escherichia coli OP50-Kultur auf die Platten geben und einen Tag lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 200 Mikroliter 0,025 molare D-Glukose auf vier NGM-Agarplatten geben und bei Raumtemperatur trocknen lassen.
Übertragen Sie drei bis vier Stücke von Caenorhabditis elegans Bristol N2 in verschiedenen Stadien von einer Erhaltungs-NGM-Agarplatte auf eine neue NGM-Platte, die mit E.coli OP50 besetzt ist. Inkubieren Sie die C.elegans-Würmer drei Tage lang bei 20 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von mehr als 95 %. Drei Tage danach destilliertes Wasser auf den Teller geben und mit einer Pasteur-Pipette die Würmer auffangen.
Übertragen Sie die gesammelten Würmer in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie sie durch die Schwerkraft sedimentieren, bevor Sie den Überstand aus dem Röhrchen entfernen. Geben Sie dann destilliertes Wasser in das Röhrchen. Sobald das Volumen der Tube auf fünf Milliliter reduziert ist, fügen Sie 10 Milliliter Bleichlösung hinzu und schütteln Sie die Tube etwa sechs Minuten lang kräftig.
Füllen Sie dann das Röhrchen bis zu einem Fassungsvermögen von 50 Millilitern mit M9-Puffer und zentrifugieren Sie es drei Minuten lang bei 1400 g. Entfernen Sie den Überstand bis zu fünf Millilitern und geben Sie 45 Milliliter M9-Puffer in das Röhrchen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Überstand bis zur 15-Milliliter-Markierung und geben Sie die restliche Flüssigkeit auf eine Platte.
Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop auf die Freisetzung von Eiern und stellen Sie die Platte 14 Stunden lang bei 20 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von mehr als 95 % auf. Nach der Inkubation sammeln Sie die Würmer in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie mit einer automatischen Pipette 10 Mikroliter der synchronisierten Würmer in einen Objektträger.
Zählen Sie die Anzahl der Würmer und berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um 500 bis 1000 Würmer pro Mikroliter zu erhalten. Übertragen Sie 500 bis 1000 synchronisierte Würmer im Larvenstadium eins oder L1 auf die NGM-Agarplatten. Zuvor zubereitet und mit E.coli OP50 und Glukose besiedelt.
Inkubieren Sie die Platte bei 20 Grad Celsius, bis die Würmer das vierte Larvenstadium oder L4 erreichen. Geben Sie nach 48 Stunden M9-Puffer auf die Platte und sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette L4-Larven. Übertragen Sie die gesammelten Larven in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entwerfen Sie den Assay-Zeitplan für drei Versuchsgruppen.
Übertragen Sie etwa 100 Mikroliter Wurmsuspension aus jeder Gruppe in das 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen, das 400 Mikroliter 5%ige Lugolsche Jodlösung enthält. Rühren Sie das Rohr in einem Mischer fünf Minuten lang vorsichtig um. Nachdem Sie das Rohr aus dem Mischer genommen haben, warten Sie, bis sich die Würmer durch die Schwerkraft sedimentiert haben.
Waschen Sie die Würmer dreimal mit einem Milliliter M9-Puffer. Nach dem erneuten Suspendieren der Würmer in 100 Mikrolitern M9-Puffer. Übertragen Sie ca. 50 Mikroliter auf den Objektträger.
Legen Sie das Deckglas auf die Folie. Wählen Sie als Nächstes an einem Stereomikroskop den Hellfeldmodus und beobachten Sie die Würmer. Speichern Sie die Bilder, die mindestens 10 Würmer pro Gruppe enthalten, als JPEG-Datei.
Berechnen Sie abschließend den Glykogengehalt anhand der Jodfärbung von Würmern. Visuelle Beobachtungen des Glykogengehalts-Assays zeigten, dass nüchterne Würmer eine schwächere Färbung aufwiesen als diejenigen, die mit E.coli OP50 gefüttert wurden, und solche mit E.coli OP50 und D-Glucose, die die intensivste Färbung aufwiesen.
