Zu Beginn werden 500 bis 1.000 synchronisierte Caenorhabditis elegans-Würmer im L1-Stadium auf eine NGM-Agarplatte übertragen und bis zum Tag des Tests bei 20 Grad Celsius inkubiert. Entwerfen Sie den Assay-Zeitplan für zwei Versuchsgruppen. Sammeln Sie mit M9-Puffer L4-Würmer und Würmer im Erwachsenenalter am jeweiligen Tag.
Füllen Sie die gesammelten Würmer in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und warten Sie, bis die Würmer durch die Schwerkraft sedimentiert sind. Waschen Sie die Würmer dreimal mit einem Milliliter M9-Puffer und lassen Sie nach dem letzten Waschen etwa 500 Mikroliter in der Tube. Geben Sie mit einer automatischen Pipette 10 Mikroliter der Wurmsuspension in einen Objektträger und berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um 100 Würmer pro Mikroliter zu erhalten.
In ein neues Mikroröhrchen das für 100 Würmer erforderliche Volumen und 100 Mikroliter 25%ige Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung geben. Fügen Sie dann 200 Mikroliter E.coli OP50-Kultur hinzu und erhöhen Sie das Volumen mit einem M9-Puffer auf 500 Mikroliter. Inkubieren Sie das Röhrchen drei Stunden lang unter Rühren in einem Mischer und schützen Sie es vor Licht.
Lassen Sie die Würmer nach der Inkubation durch die Schwerkraft sedimentieren, bevor Sie sie mit einem Milliliter M9-Puffer waschen, bis die Färbelösung vollständig entfernt ist. Nach dem letzten Waschen die Würmer in 250 Mikrolitern M9-Puffer resuspendieren und ca. 50 Mikroliter auf den Objektträger übertragen. Legen Sie das Deckglas auf und inkubieren Sie das Objektträger 10 Minuten lang bei 20 Grad Celsius, um die Würmer zu lähmen.
Zählen Sie mit einem Stereomikroskop im Hellfeldmodus die Gesamtzahl der Würmer und die Gesamtzahl der gefärbten Würmer. Der intestinale Permeabilitätstest zeigte bei jungen Würmern eine starke Darmbarriere, die ein Austreten von Farbstoffen verhinderte. Im Gegensatz dazu zeigten gealterte Würmer eine Farbstoffextravasation im gesamten Körper, was auf eine Schädigung der Darmmembran hinweist.
