Laden Sie zunächst fünf Mikroliter Hoechst-Lösung in eine sterile 10-Mikroliter-Glasspritze von Hamilton, die an einer stumpfen 34-Gauge-Nadel befestigt ist. Führen Sie diese Spritzennadel durch den selbstdichtenden Hornhauttunnel in die Vorderkammer ein und injizieren Sie die Lösung. Halten Sie die Nadel zwei bis drei Sekunden lang an Ort und Stelle, bis die gesamte Flüssigkeit verschwunden ist.
Ziehen Sie die Nadel langsam heraus, um sie zu entfernen, um ein Auslaufen zu vermeiden. Als nächstes enukleieren Sie beide Augen. Um die Hornhaut zu isolieren, schneiden Sie die Sklera um den Sehnerv herum und machen Sie vier weitere Schnitte vom Sehnerv in Richtung Hornhaut.
Lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit dem Whatman-Filterpapier ab. Spreizen Sie die abgeschnittene Sklera und trennen Sie die Netzhaut von der Sklera. Ziehen Sie die Linse und die Netzhaut heraus und entsorgen Sie sie.
Entfernen Sie als Nächstes die Iris. Schneiden Sie die Sklera um die Hornhaut herum ab und entsorgen Sie sie. Und heben Sie die Hornhaut vorsichtig an.
Legen Sie die Hornhäute auf einen Objektträger und färben Sie sie mit 0,5 % Alizarinrot, um Endothelzellen zu identifizieren. Nachdem Sie den überschüssigen Fleck entfernt haben, waschen Sie die Hornhaut dreimal und legen Sie einen Deckzettel darauf. Untersuchen Sie die Hornhäute unter einem Lichtmikroskop, um die Alizarinrot-Färbung von Endothelzellen abzubilden.
Untersuchen Sie die Hornhäute auch unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Hoechst-Färbung zu beobachten, und vergleichen Sie sie mit der nicht injizierten Hornhaut als Kontrolle. Der Hoechst-Farbstoff, ein DNA-bindender zellpermeabler fluoreszierender Marker, wurde zur Beurteilung der Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln durch intrakamerale Injektion verwendet. Die Aufnahme von Hornhaut-Endothelzellen von hoechst wurde 15 Minuten nach der Injektion fluoreszenzmikroskopisch untersucht.
Die Alizarinrot-Färbung hob die interzellulären Grenzen der Endothelschicht hervor. Auch die positive Hoechst-Färbung in den Endothelzellkernen der Hornhaut bestätigte die erfolgreiche Abgabe des Farbstoffs über diese Methode.
