Bevor Sie mit der Isolierung des Mausembryos beginnen, reinigen Sie den Bereich gründlich mit 70%igem Ethanol. Stellen Sie sicher, dass alle Sezierwerkzeuge gewaschen und sterilisiert sind. Besorgen Sie sich fünf Milliliter steriles DMEM mit 10 % FBS und 20 Milliliter DPBS und legen Sie sie auf Eis.
Um die Isolierung des Embryos durchzuführen, legen Sie anschließend mit einem Stereomikroskop mit Durchlichttisch und Kamera die ordnungsgemäß eingeschläferte schwangere Muttermutter auf den Rücken und sterilisieren Sie den Bereich in der Nähe der Vaginalöffnung mit Ethanol. Heben Sie mit einer Präparierschere und einer Pinzette die Hautfalte in der Nähe der Vaginalöffnung an und machen Sie einen kleinen V-förmigen Schnitt, der langsam die Gebärmutter der schwangeren Hündin freilegt. Präpariere dann das Gebärmutterhorn des Damms, indem du ein Ende mit einer Pinzette festhältst und daran entlang schneidest.
Achten Sie darauf, den Gebärmutterhals zu entfernen. Legen Sie das Gebärmutterhorn in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die DPBS auf Eis enthält. Entfernen Sie mit einer Präparierschere und einer Pinzette den Gebärmuttermuskel entlang der Implantationsstellen und schneiden Sie jede Implantationsstelle oder Perlen mit den Dezidualschwellungen im Inneren auf.
Legen Sie es in frisches DPBS in eine sechs Zentimeter große Petrischale auf Eis. Nehmen Sie eine Implantationsstelle. Platzieren Sie es in einer neuen, sechs Zentimeter großen Petrischale auf dem Stereomikroskoptisch und fügen Sie 500 Mikroliter DPBS hinzu.
Stellen Sie den Fokus des Mikroskops und die Lichtquelle ein. Halten Sie die Implantationsstelle mit einer Pinzette in einer Hand nach unten und führen Sie mit der anderen Hand langsam eine weitere Pinzette in das Ende der Implantationsstelle ein, die aus dem Gebärmutterhorn geschnitten wurde, so dass die Milchschwellung allmählich sichtbar wird. Um den Embryo freizulegen, halten Sie das Anti-Mistrial-Ende der isolierten Dezidualschwellung mit einer Pinzette fest und machen Sie mit dem anderen Paar langsam einen horizontalen Schnitt, der etwa ein Viertel der Größe der Deziduumschwellung vom Fehlschwellungsende aus hat.
Schieben Sie nun mit beiden Pinzetten langsam aus dem Anti-Mistrial-Ende der Dezidualschwellung, bis der Embryo aus dem frisch geschnittenen Mistrial-Ende herausspringt. Sobald der Embryo freigelegt ist, fahren Sie mit der Entfernung von überschüssigem embryonalem Gewebe fort. Wenn sich der parietale endodermale Sack und der ekto-Plazentakegel nicht spontan vom Embryo lösen, verwenden Sie eine Pinzette, um sie zusammen mit dem zugehörigen mütterlichen Blut zu entfernen.
Während Sie den Embryo mit einer Pinzette festhalten, schälen Sie dann langsam den viszeralen Dottersack mit einer anderen Pinzette vom Embryo. Lokalisieren Sie den parietalen endodermalen Sack und den ektoplazentären Kegel. Übertragen Sie den Dottersack mit nicht mehr als 10 Mikrolitern DPBS aus der Schale mit einer AP 20-Pipette in ein PCR-Röhrchen mit acht Streifen auf Eis.
Machen Sie Hellfeldfotos von frisch isolierten Embryonen, um sicherzustellen, dass das Staging der Wurfgeschwister ähnlich ist. Übertragen Sie den Embryo mit einer P200-Pipette langsam mit 50 Mikrolitern DMEM mit 10% FBS in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gehalten wird. Wiederholen Sie das Gleiche für alle Dezidualquellungen, wobei Sie für jede Isolierung saubere Werkzeuge und neue Kunststoffe verwenden.
