Nachdem Sie den viszeralen Dottersack aus dem Mausembryo isoliert haben, verdauen Sie jeden Dottersack in einem Polymerase-Kettenreaktions- oder PCR-Röhrchen mit acht Streifen. Geben Sie mit einer P20-Pipette 19,3 Mikroliter PCR-Template-DNA-Lysepuffer und 0,7 Mikroliter 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K zu jeder Dottersackprobe. Die Probe 10 Sekunden lang vortexen.
Und mit einer Mini-Zentrifuge mit einem Streifenadapter schleudern Sie die Proben 10 Sekunden lang bei 1000 g herunter. Legen Sie das PCR-Röhrchen mit acht Streifen für 45 Minuten in einen 85 Grad Celsius heißen Block, während Sie alle fünf Minuten fünf Sekunden lang vortexen. Nach 45 Minuten drehen Sie den Röhrchenstreifen erneut 10 Sekunden lang bei 1000 g nach unten, bevor Sie mit der PCR zur gewünschten genetischen Identifizierung fortfahren.
Um die PCR-Reaktion für die Cre-Genotypisierung durchzuführen, bereiten Sie einen PCR-Mastermix vor, der die angezeigten Komponenten pro Acht-Streifen-PCR-Röhrchen für jeden Dottersack enthält. Fahren Sie mit der Ausführung des PCR-Amplifikationsprogramms für den thermischen Zyklus unter Verwendung des angezeigten Zyklus fort. Lassen Sie dann die PCR-Produkte auf einem 1%-Agarose-Gel laufen, um Rückschlüsse auf die Genotypisierung zu ziehen.
Lagern Sie die restlichen Proben des verdauten Dottersacks zur Langzeitlagerung in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Bei der Trennung des PCR-Produkts auf einem Agarosegel wurden die erwarteten Fragmentgrößen für die LoxP- und Wildtyp-Allele sowie das Cre-Allel gesehen.
