Fahren Sie mit der Zelldissoziation isolierter muriner Embryonen fort, sobald die Genotypen bestätigt wurden. Geben Sie mit einer P200-Pipette 50 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie Embryonen mit demselben Genotyp in die neue Röhre gepoolt haben, legen Sie sie auf Eis.
Lassen Sie die gepoolten Embryonen am Boden des Röhrchens absetzen, waschen Sie die Embryonen dann mit 50 Mikrolitern DPBS und warten Sie, bis sie sich gesetzt haben, bevor Sie so viel DPBS wie möglich entfernen, ohne die Embryonen zu entfernen. Als nächstes gibst du 100 Mikroliter Trypsin zu den gepoolten Embryonen und inkubierst bei 37 Grad Celsius in einem Wärmeblock für fünf Minuten. Schnippen Sie alle 30 Sekunden vorsichtig mit dem 1,5-Milliliter-Röhrchen, um die Disssoziation der Zellen zu unterstützen.
Nach fünf Minuten neutralisieren Sie das Trypsin mit 300 Mikrolitern DMEM mit 10 % FBS. Zentrifugieren Sie die Embryonen bei 100 g für vier Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie das erhaltene kleine Pellet in 40 Mikrolitern DMEM mit 10%FBS und legen Sie das Rohr auf Eis.
Mischen Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension mit fünf Mikrolitern Trypanblau in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und pipettieren Sie die Mischung gründlich auf und ab. Übertragen Sie die Mischung auf einen Objektträger, um die Zellzahl und Viabilität mit einem automatisierten Zellzähler zu bestimmen. Fahren Sie schließlich mit der Einzelzellpartitionierung mit einem mikrofluidischen Chip fort, wobei Sie dem Protokoll des Herstellers folgen.
