Nachdem Sie die von Morbus Crohn-Patienten stammenden Kolonoide in einer 48-Well-Platte expandiert haben, entfernen Sie das Medium vorsichtig vom Rand der Vertiefung, ohne die Kolonoidkuppel zu beschädigen. Geben Sie 300 Mikroliter enzymatisches Dissoziationsreagenz, ergänzt mit 10 mikromolaren ROC1 und zwei Inhibitoren Y-27632, in jede Vertiefung. Kratzen Sie mit einer P1000-Pipettenspitze die Oberfläche der Vertiefung ab, um die Kolonoidkuppel zu durchbrechen, und pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die gesammelten Koloide fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Zentrifugieren Sie die Koloide bei 400 x g für drei Minuten und entfernen Sie den Überstand, wobei etwa 1,2 Milliliter im Röhrchen verbleiben.
Legen Sie dann die Spitze der P1000-Pipette in die Suspension, halten Sie sie knapp über dem Boden des Röhrchens und pipettieren Sie die Suspension schnell in die Spitze hinein und wieder heraus, um die Koloide zu dissoziieren. Beobachten Sie das Röhrchen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass keine ganzen Kolonoide übrig bleiben. Und die Fragmente der Kolonoide sind etwa 30 bis 40 Mikrometer groß.
Geben Sie anschließend 10 Milliliter eiskaltes Organoid-Waschmedium in das 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskaltem Organoid-Waschmedium.
Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und beschriften Sie es als Kolonoidfragmentröhrchen. Füllen Sie nach dem Mischen 50 Mikroliter der Probe in ein neues Röhrchen und beschriften Sie es als Zellzählröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für drei Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern enzymatischem Dissoziationsreagenz, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632. Inkubieren Sie das einzelne Zellzählröhrchen fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Pipettieren Sie die Probe mit einer P1000-Pipette auf 400 Mikroliter schnell.
Betrachten Sie dann die Probe unter einem Mikroskop, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Geben Sie einen Milliliter Organoid-Waschmedium in das Einzelzellzählröhrchen. Zentrifugieren Sie dann die Suspension und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 50 Mikrolitern organoidem Waschmedium resuspendieren.
Fügen Sie 50 Mikroliter Trypanblau hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie auf dieser Grundlage die Konzentration der Zellen im Dickdarmfragmentröhrchen. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen in einem neuen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Entfernen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in Basalmembranextrakt (BME). Pipettieren Sie nun in einer vorinkubierten 96-Well-Mikrotiterplatte 10 Mikroliter der Colonoid-BME-Lösung pro Vertiefung und mischen Sie die Lösung regelmäßig sorgfältig, um eine ungleichmäßige Aussaat zu vermeiden.
Drehen Sie die Platte um und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach 20 Minuten überlagern Sie die Kuppeln mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Organoid-Proliferationsmedium und setzen Sie die Inkubation drei Tage lang fort.
