Nachdem Sie die von Morbus Crohn-Patienten stammenden Kolonoide drei Tage lang inkubiert haben, kippen Sie die Platte und entfernen Sie das Medium vom Rand der Vertiefungen. Fügen Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung Zytokin-Behandlungsmedium hinzu, das 2,5 mikromolare fluoreszierende Zelltodfarbstoffe enthält. Inkubieren Sie die Koloide bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für die erforderliche Behandlungszeit.
Nach der Inkubation stellen Sie die Platte auf den Tisch eines digital inversen Epifluoreszenzmikroskops und vergewissern Sie sich, dass die Koloide unter der maximalen Toxizitätsbedingung vollständig lysiert sind. Fokussieren Sie sich über den Übertragungskanal auf ein Coloid mit SYTOX-positiven Zellen. Wechseln Sie dann zum GFP-Kanal.
Passen Sie die Lichtintensität und die Belichtungszeit an, um das Fluoreszenzsignal zu maximieren und gleichzeitig den Hintergrund zu minimieren. Beobachten Sie mit optimierten Bildeinstellungen die Bedingungen für keinen Farbstoff und maximale Toxizität, um sicherzustellen, dass die Proben nicht über- oder unterbelichtet sind. Erfassen Sie Transmissions- und GFP-Bilder von Kolonoiden mit einem Zufallsstichprobenansatz, indem Sie Sichtfelder auswählen, die einem festen Gittermuster folgen, das die Kolonoidkuppel abdeckt.
Klicken Sie auf das Werkzeug Freihandauswahl und wählen Sie manuell den Interessenbereich auf dem Übertragungsbild aus. Wechseln Sie dann durch den Bildstapel zum entsprechenden GFP-Kanalbild. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Analysieren und Messungen festlegen.
Aktivieren Sie im Dialogfenster "Maße festlegen" den mittleren Grauwert und lassen Sie die anderen Kästchen deaktiviert. Wenn das GFP-Bild ausgewählt ist, klicken Sie auf Analysieren und messen. Nachdem das Dataset analysiert wurde, kopieren Sie alle Daten im Ergebnisfenster und fügen Sie sie in eine Tabelle ein.
Berechnen Sie den Mittelwert der mittleren Grauwerte des technischen Replikats für jede Bedingung. Subtrahieren Sie den Mittelwert der unbehandelten Erkrankung von jeder Behandlungsbedingung. Teilen Sie dann jede Behandlungsbedingung durch den hintergrundsubtrahierten Mittelwert der maximalen Toxizitätsbedingung.
Um die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Behandlung zu berechnen, subtrahieren Sie die normalisierten Werte von eins. Berechnen Sie mit der gegebenen Gleichung den Koeffizienten der Wechselwirkung zwischen Störungen. Transmissionsfluoreszenz-Overlay-Bilder von Kolonoiden nach acht Stunden zeigten, dass nur die mit Interferon gamma plus TNF alpha behandelten Koloide positiv für das Fluoreszenzsignal waren.
Nach 24 Stunden zeigten Koloide, die mit Interferon gamma plus TNF alpha behandelt wurden, große Regionen, die positiv für das Fluoreszenzsignal waren, mit einer deutlichen Aufschlüsselung der Kolonoidmorphologie. Der Zelltod nach acht Stunden war bei BSA-kontrollierten Kolonoiden niedrig, mit einem leichten Anstieg bei TNF-alpha-behandelten Erkrankungen. Nach 24 Stunden zeigten Interferon-gamma- plus TNF-alpha-behandelte Koloide die höchsten Zelltodraten.
Die VPI-Werte zeigten einen leichten Synergismus nach acht Stunden und einen erheblichen Synergismus nach 24 Stunden. Dies bestätigte eine zeitabhängige synergistische Wechselwirkung zwischen Interferon gamma und TNF alpha.
