Nehmen Sie zunächst eine Glasschale mit dicht schließendem Deckel. Lege einen Wattebausch in die Schüssel. Geben Sie unter einem Abzug drei bis fünf Milliliter Ethylether in den Wattebausch.
Decken Sie die Schüssel sofort mit dem Deckel ab. Verwende einen Pinsel, um die dritte Larve von Drosophila aus Fliegenfläschchen aufzuheben. Setze eine Larve in ein kleines, offenes Gefäß um.
Stellen Sie den Behälter in die mit Ethylether besprühte Glasschale und verschließen Sie die Schale sofort fest. Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um die Larve alle 30 Sekunden auf Beweglichkeit zu überprüfen. Übertragen Sie die betäubte Larve auf einen Glasobjektträger.
Tauchen Sie die Larven in einen Tropfen Insektensalzlösung. Unter dem Präpariermikroskop. Entfernen Sie den größten Teil der Kochsalzlösung mit einem Papiertaschentuch.
Positionieren Sie die dorsale Seite der Larve nach oben für die Riesenfaserablation oder die ventrale Seite nach oben für die TTMn-Ablation. Senken Sie dann langsam einen Glasdeckel auf die Larve ab. Fügen Sie Kochsalzlösung an der Seite des Deckglases hinzu.
Zum Ausfüllen des Raumes zwischen dem Glasschieber und dem Deckglas. Bei der Riesenfaserablation überprüfen Sie die Positionierung des Gehirns unter starker Vergrößerung am Dissektionsmikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn waagerecht liegt und durch die Nagelhaut sichtbar ist.
Um das Fettgewebe, das das Gehirn bedeckt, zu verdrängen, üben Sie mit einer Pinzette leichten Druck auf den Deckschirm aus und bewegen Sie den Deckschirm von einer Seite zur anderen. Legen Sie die Probe auf einen Multiphotonen-Mikroskoptisch. Verwenden Sie den GFP-Filter, um die Probe im Epifluoreszenzmodus zu lokalisieren.
Konzentrieren Sie sich für die Ablation von Riesenfasern auf die interessierenden Zellen und wechseln Sie dann in den Zwei-Photonen-Modus. Stellen Sie den Laser auf 870 Nanometer ein und passen Sie die Detektorverstärkung an, um die GFP-exprimierenden Zellen mit dem Galvano-Scanner zu betrachten, und definieren Sie den Bereich für die Ablation anhand eines kreisförmigen Interessenbereichs. Fahren Sie als Nächstes mit der Einrichtung des Ablationsprotokolls in der Software fort, um dies zu tun, stellen Sie nacheinander einen Aufnahmerahmen ein, die Stimulation, gefolgt von einem weiteren Aufnahmerahmen.
Starten Sie die Stimulationslaserleistung bei einem niedrigeren Wert und führen Sie das Stimulationsprotokoll aus. Wenn die Ablation nicht erfolgreich war und die Zelle nur gebleicht wurde, erhöhen Sie die Laserleistung in Schritten von 5 % oder die Anzahl der Schleifen nacheinander und führen Sie das Protokoll erneut aus. Tun Sie dies, bis eine erfolgreiche Zellablation zu sehen ist.
Entfernen Sie nach erfolgreichem Abtragen der Zelle den Deckglas. Heben Sie die Larven vorsichtig mit einem Pinsel vom Objektträger auf und geben Sie die Larven dann in ein Futterfläschchen. In Proben für die Ablation von Riesenfasern.
Die Ablation wurde durch das Fehlen eines GFP-markierten Somas auf der ablierten Seite des Gehirns verifiziert. Für die TTMn ablierten Larven. Das Fehlen von TTMn auf einer Seite war aufgrund des Fehlens von Soma und Dendriten leicht zu erkennen.
