Isolierung von Exosomen aus Zellen des Eierstockepithelkarzinoms der Maus zur Erzeugung von Mikronadelpflastern

Nehmen Sie zunächst kultivierte Eierstockepithelkarzinomzellen der Maus. Nehmen Sie das Nährmedium aus den Petrischalen und waschen Sie es zweimal mit DPBS. Fügen Sie 20 Milliliter Dulbecco's Modified Eagle Medium ohne FBS und Penicillin-Streptomycin-Lösung hinzu.

Inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Sammeln Sie dann den Zellkulturüberstand aus 20 Petrischalen mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern. Bei 300 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand auffangen.

Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand, um Zelltrümmer zu entfernen. Schalten Sie nun die Vakuumpumpe ein und schließen Sie sie an den Lufteinlass des Vakuumfiltersystems an. Filtern Sie den Überstand durch die 0,22-Mikron-Polyethersulfonmembran, um Vesikel oder Verunreinigungen zu entfernen, die größer als 0,22 Mikrometer sind.

Geben Sie 15 Milliliter des gefilterten Überstands in das Innenrohr des 100-Kilodalton-Ultrafiltrationsrohrs. Zentrifugieren Sie bei 3.500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entferne dann die Flüssigkeit aus dem Außenrohr.

Sammle als Nächstes die Flüssigkeit aus dem Schlauch. Geben Sie einen Milliliter DPBS in den Schlauch. Pipettieren Sie wiederholt, um die Exosomen wieder zu resuspendieren, und sammeln Sie sie dann.

Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit bei 10.000 g für 60 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein Sechs-Milliliter-Schnellverschluss-Zentrifugenröhrchen umfüllen und mit einem Heißsiegelgerät verschließen. Schneiden Sie das Röhrchen auf, nachdem Sie den Überstand zwei Stunden lang ultrazentrifugiert haben.

Sobald der Überstand entfernt ist, resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern DPBS, um die Exosomenlösung zu erhalten.