Waschen Sie zunächst die frische menschliche Vorhofprobe in einer 100-Millimeter-Glasplatte, die steriles HBSS enthält. Schütteln Sie die Proben in der Platte vorsichtig, um Blutreste zu entfernen. Übertragen Sie die Probe auf eine 100-Millimeter-Platte, die mit einem kleinen Volumen HBSS benetzt ist.
Zerkleinern Sie die Probe mit gekreuzten Skalpellen in zwei Millimeter große Würfel. Übertragen Sie als Nächstes vier kleine Myokardfragmente auf eine 35-Millimeter-Platte. Legen Sie ein steriles Deckglas über die Scherben und üben Sie leichten Druck aus.
Pipettieren Sie 1,5 Milliliter DMEM in die Platte. Dann inkubieren Sie die Kulturplatten bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxidzusatz. Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 85 % erreicht haben, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und heben Sie das Deckglas mit einer sterilen Pinzette an.
Legen Sie es dann kopfüber auf eine neue 35 Millimeter Platte. Fügen Sie dann steriles PBS hinzu, um es auszuspülen. Entfernen Sie nun die Myokardfragmente.
Pipettieren Sie dann DMEM aus der Platte. Verwenden Sie steriles PBS, um die Platte mit den herausgewachsenen Zellen zu spülen. Nachdem Sie die Spülung verworfen haben, geben Sie einen Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA auf jede Platte und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Nehmen Sie nach der Inkubation die Platten aus dem Inkubator und bestätigen Sie mit einem Mikroskop die Zellablösung. Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter Trypsin-Stopp-Lösung oder TSS in jede Platte, um die Trypsinisierung zu blockieren. Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Zentrifugen Sie es bei 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette. Geben Sie dann drei Milliliter DMEM zum Pellet und resuspendieren Sie es.
Legen Sie die Zellsuspension auf eine 60 Millimeter große Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, unter 5% Kohlendioxid-Ergänzung. Als nächstes pipettieren Sie drei Milliliter sterile 0,2%ige Gelatinelösung auf jede 60-Millimeter-Platte.
Nach der Inkubation die Lösung aspirieren und bis zur weiteren Verwendung drei Milliliter steriles PBS hinzufügen. Nehmen Sie die Platte mit den Herzfibroblasten aus dem Inkubator. Entfernen Sie DMEM von der Platte und spülen Sie es mit sterilem PBS ab.
Nachdem Sie die Spülung verworfen haben, geben Sie einen Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA auf jede Platte. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellablösung zu bestätigen. Geben Sie als nächstes zwei Milliliter TSS in jede Platte, um die Trypsinisierung zu blockieren.
Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugen Sie es bei 400 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette.
Geben Sie dann drei Milliliter DMEM zum Pellet und resuspendieren Sie es. Entfernen Sie das PBS von der 60 Millimeter gelatinebeschichteten Platte und legen Sie die Zellsuspension in die Platte. Kultivieren Sie die Fibroblasten bis zu 21 Tage lang in einem Konfluenzzustand.
Nach 21 Tagen Kultur aspirieren Sie das Kulturmedium. Spülen Sie dann die Platten mit drei Millilitern PBS aus. Nach dem Aspirieren des PBS und der Zugabe von einem Milliliter Dezellularisierungslösung beobachten Sie die Platte unter einem inversen Kontrastmikroskop.
Pipettieren Sie nach zwei Minuten vorsichtig vier Milliliter PBS, um die Dezellularisierungslösung in den Platten zu verdünnen. Aspirieren Sie die verdünnte Lösung. Spülen Sie die Platten dann vorsichtig mit PBS aus.
Zum Schluss gibst du einen Milliliter PBS auf die Teller. Lagern Sie die mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platten bis zur weiteren Verwendung bei vier Grad Celsius. Das Auswachsen von Fibroblasten aus den kleinen Fragmenten des nativen Myokards, die in Kultur gebracht wurden, wurde innerhalb von drei bis fünf Tagen beobachtet.
Die Dezellularisierung führte zu einer extrazellulären Matrixbeschichtung auf der Plattenoberfläche. Die Zusammensetzung und Architektur der in vitro hergestellten extrazellulären Matrix des Herzens blieb durch die Dezellularisierung erhalten.
