Beladung von primären CD4⁺ T-Zellen der Maus und Beschichtung von Protein G Magnetischen Kügelchen mit Antikörpern für die lokale Ca2⁺ -Bildgebung

Nehmen Sie zunächst CD4-positive T-Zellen, die aus Lymphknoten und Milz der Maus isoliert wurden. Zentrifugieren Sie zwei bis fünf Millionen Zellen fünf Minuten lang bei 300 g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 480 Mikrolitern T-Zellmedium, das 10 mikromolare Fluo-4 AM und 20 mikromolare Fura Red AM enthält. Decken Sie das Falcon-Röhrchen mit Alufolie ab und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Geben Sie dann zwei Milliliter T-Zell-Medium in die Zellen und inkubieren Sie weitere 30 Minuten lang. Mischen Sie die Protein G Magnetbead-Suspension vorsichtig und geben Sie 12,5 Mikroliter in ein neues Röhrchen. Stellen Sie das Rohr auf einen Magnetständer, damit die Kügelchen zum Magneten wandern können.

Pipettieren Sie den Aufbewahrungspuffer vorsichtig von der gegenüberliegenden Seite des Magneten heraus, um ihn zu entfernen. Um den restlichen Lagerpuffer zu entfernen, fügen Sie 500 Mikroliter PBST hinzu und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang ein. Legen Sie das Rohr wieder auf das Magnetstativ und entfernen Sie den Puffer.

Um die Kügelchen mit Antikörpern zu beschichten, resuspendieren Sie sie in 7,5 Mikrolitern PBST und fügen Sie jeweils fünf Mikroliter Anti-CD3 und Anti-CD28 hinzu. 30 bis 60 Minuten unter kontinuierlichem Mischen bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die beschichteten Kügelchen dreimal mit 500 Mikrolitern PBST, gefolgt von einer Wäsche mit 500 Mikrolitern Kalziumpuffer mit dem Magnetständer, dann resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 bis 400 Mikrolitern Kalziumpuffer.