Detektion von Ca2⁺ -Mikrodomänen auf subzellulärer Ebene in primären murinen T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Legen Sie zunächst 10 Mikroliter der geladenen CD4+-Zellen auf den vorbereiteten Objektträger und lassen Sie sie drei bis fünf Minuten lang anhaften. Geben Sie vorsichtig 80 Mikroliter Calcium-Messpuffer in den Objektträger. Wählen Sie die 100X Öl-Immersionslinse.

Tragen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf und legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie dann den Fokus im Hellfeldmodus ein. Wählen Sie ein Sichtfeld mit bis zu 10 Zellen aus, die nicht miteinander in Kontakt stehen, und nehmen Sie ein Bild auf.

Fügen Sie anschließend nach einer Minute 10 Mikroliter antikörperbeschichtete Kügelchen oder Stimulans hinzu und messen Sie insgesamt drei Minuten lang mit 40 Bildern pro Sekunde oder der maximal möglichen Bildrate. Verwenden Sie den Schieberegler, um die Zeit des Kontakts zwischen einer Perle und einer interessierenden Zelle zu bestimmen. Wählen Sie im Menü "Optionen" auf der rechten Seite die Option "Perlenkontakt": x, y, t.

Wählen Sie die Stelle auf der linken Seite des Bildes aus, an der sich die Zelle und die Perle berühren. Wählen Sie Zelle auswählen, indem Sie auf einen Punkt darin klicken. Klicken Sie auf die Zelle, die durch diese Perle stimuliert wird, vorzugsweise in der Mitte.

Klicken Sie auf BEAD-Kontakt hinzufügen. Sobald alle Kügelchenkontakte definiert sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter und fahren Sie mit weiteren Dateien fort. Wildtyp-Zellen zeigten innerhalb der ersten Sekunde nach der Stimulation eine schnelle Bildung von Kalzium-Mikrodomänen, die sich in den folgenden 15 Sekunden in der gesamten Zelle ausdehnten. Umgekehrt zeigten P2x4- und P2x7-mutierte Zellen eine verminderte Bildung von Kalzium-Mikrodomänen, wobei P2x4-mutierte Zellen vor der Stimulation auch ein niedrigeres Basalniveau aufwiesen.

Wie bei murinen T-Zellen wurden auch in humanen CD4+T-Zellen Kalzium-Mikrodomänen an der Kontaktstelle der Kügelchen beobachtet.