Legen Sie zu Beginn gefrorene Trophozoiten von Naegleria gruberi drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Trophozoiten werden in PYNFH-Medien bei 25 Grad Celsius kultiviert, bis sie zu etwa 80 % konfluieren. Legen Sie den konfluenten Kolben für fünf bis 10 Minuten auf Eis, um die anhaftenden Trophozoiten aus dem Kunststoff zu lösen.
Schwenken Sie dann den Kolben vorsichtig, um alle verbleibenden anhaftenden Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das Medium durch ein steriles Zystmedium, um die Naegleria gruberi-Zellen zu enzysten. Entfernen Sie nach 48 Stunden die Zysten aus dem Kolben.
Zentrifugen Sie die Zysten bei 600 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zysten in zwei Millilitern PYNFH-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum, um die Zellen zu exzysten. Inkubieren Sie die Zysten 72 Stunden lang bei 25 Grad Celsius, bis Trophozoiten auftauchen und eine Konfluenz von 80 % erreichen.
Um die Trophozoiten zu transfizieren, wird zunächst ein Milliliter der Trophozoiten in eine sechs Vertiefungen fassende Gewebekulturplatte mit flachem Boden gefüllt. Inkubieren Sie anschließend die Mischung aus Plasmidtransfektionsreagenzien 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie etwa 800 Mikroliter Medium aus den Trophozoiten-Monoschichten kurz vor der Transfektion.
Geben Sie dann 200 Mikroliter des Plasmidtransfektionsreagenzgemisches zu den Trophozoiten. Schwenken Sie die Platte alle 15 Minuten vorsichtig, um zu verhindern, dass sich das Medium an den Rändern der Platte ansammelt und austrocknet. Geben Sie nach einer Stunde 10 Einheiten DNase in einen Milliliter 10X DNase Puffer und geben Sie ihn in die Vertiefungen.
Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die verbleibende Plasmid-DNA zu entfernen. Waschen Sie nun die Platte einmal mit einem Milliliter Anzuchtmedium und fügen Sie dann zwei Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 25 Grad Celsius für 24 bis 36 Stunden.
Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, teilen Sie den Inhalt einer Vertiefung im Verhältnis 1:2 in eine neue Platte auf. Sammeln Sie dann die Trophozoiten aus den verbleibenden Vertiefungen für die weitere Analyse. Die Trophozoiten der Naegleria gruberi waren amöboid und hafteten unter normalen Kulturbedingungen an den Kulturflaschen.
Ihre Inkubation auf Eis führte zu runden und nicht anhaftenden Trophozoiten. Die Inkubation der Trophozoiten in Enzystationsmedien führte dazu, dass sie enzystiert wurden.
