Geben Sie zunächst 200 Mikroliter 100 millimolares Natriumchlorid in ein Röhrchen mit transfizierten Trophozoiten von Naegleria gruberi. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach Entfernen des Überstands wird das Zellpellet in 100 Mikrolitern 100 millimolar EDTA resuspendiert.
Legen Sie das Röhrchen für 15 Minuten bei 98 Grad Celsius in einen Heizblock, um die Zellen zu lysieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei Höchstgeschwindigkeit, um den Schmutz zu pelletieren. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen.
Als nächstes fügen Sie dem Überstand 0,5 Volumen Ammoniumacetat, drei Volumen absolutes Ethanol und einen Mikroliter Glykogen hinzu. Drehen Sie das Röhrchen zum Mischen mehrmals um, bevor Sie es 30 Minuten lang oder über Nacht bei minus 80 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 16.000 g.
Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 200 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu, um es vor dem Zentrifugieren zu waschen. Resuspendieren Sie das getrocknete Pellet in sterilem deionisiertem Wasser, um eine Trophozoitendichte von 10.000 Trophozoiten pro Mikroliter zu erreichen. Nach der PCR mit einem Primer, der spezifisch für die transfizierte DNA ist, und dem Nachweis der transformierten Trophozoiten fügen Sie den CERE-Proben zwei Mikroliter 6X Ladefarbstoff hinzu.
Laden Sie dann die gefärbten Proben auf ein 0,8%iges Agarose-Gel. Nachdem Sie das Gel 1,5 bis 2 Stunden lang elektrofluoresziert haben, inkubieren Sie es in DNA-Farbstoff, der in 100 Millilitern deionisiertem Wasser verdünnt ist. Übertragen Sie das gefärbte Gel für 20 Minuten in entionisiertes Wasser, um es zu entfärben.
Visualisieren Sie das Gel auf einem ultravioletten Lichtsystem, um die Ergebnisse zu dokumentieren. Die PCR-Analyse zeigte, dass pGRUB in transfizierten Trophozoiten über mindestens sieben Passagen nachgewiesen wurde. pGEM ging nach der ersten Passage verloren, was darauf hindeutet, dass das leere Plasmid von den Amöben nicht zurückgehalten wurde.
