Zu Beginn werden MSCs in einer Sechs-Well-Platte mit dem humanen MSC-Medium kultiviert, das 1 % Penicillin und Streptomycin enthält. Fahren Sie dann mit der Markierung von ARPE19 Mito-RFP-Zellen mit Zellspuren violett in der zytoplasmatischen Membran fort. Geben Sie dazu 20 Mikroliter Dimethylsulfoxid in ein Fläschchen mit dem violetten Reagenz für Zellspuren und mischen Sie es unmittelbar vor der Verwendung gut.
Züchten Sie die ARPE19 Mito-RFP-Zellen auf die gewünschte Dichte von 80 bis 90 %Um die Ladelösung vorzubereiten, verdünnen Sie die violette Stammlösung in vorgewärmtem DPBS. Entfernen Sie dann das Nährmedium von den Zellen und ersetzen Sie es durch einen Milliliter Ladelösung. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Ladelösung. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen haben, fügen Sie zwei Milliliter frisches, vollständiges Medium hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen mindestens 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zellspur violett einer Acetathydrolyse unterzogen werden kann.
Bereiten Sie als Nächstes eine 24-Well-Platte vor, indem Sie 50 Mikroliter DPBS in jede Vertiefung geben. Setzen Sie das Deckglas in die Platte ein und lassen Sie es eine Minute lang einwirken. Entfernen Sie das DPBS mit Unterdruck aus den Vertiefungen, um sicherzustellen, dass sich der Abdeckschieber nahe am Boden der Schale befindet.
Sobald die Zelldichte 80 bis 90 % erreicht, entfernen Sie das ursprüngliche Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, fügen Sie einen Milliliter des Trypsin-EDTA-DPBS-Gemischs hinzu und inkubieren Sie drei bis vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Sechs-Well-Platte, um die anhaftenden Zellen zu lösen. Fügen Sie einen Milliliter frisches, vollständiges Medium hinzu, um die Verdauung zu beenden.
Anschließend werden alle Zellen vorsichtig mit einer Pipettenpistole resuspendiert und alle gesammelten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie nun die Zellen bei 200 G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Medium.
Geben Sie 10 Mikroliter Zellsuspension zur Zählung auf eine Zählplatte. Nach dem Aussäen der MSC- und ARPE19-Zellen in der 24-Well-Platte beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Schütteln Sie die Platte, bis die Zellen gleichmäßig verteilt sind.
Inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in der Kultur. Für indirekte Co-Kultur siehe 10.000 ARPE19-Zellen in 500 Mikrolitern Medium pro Well einer 24-Well-Platte. Setzen Sie den Einsatz in die Vertiefung ein, in der die Zellen ausgesät wurden.
10.000 mesenchymale Stammzellen in 100 Mikrolitern Medium in der oberen Zellkammer pro Vertiefung aussäen.
