Nehmen Sie zunächst die co-kultivierten MSC-Mito-GFP- und ARPE19-Mito-RFP-Zellen und entfernen Sie das Medium von den 24-Well-Platten. Waschen Sie alle Zellen einmal mit 500 Mikrolitern 4%Polyformaldehyd pro Well. Fügen Sie 500 Mikroliter frisches 4%iges Polyformaldehyd hinzu und fixieren Sie die Proben für 20 Minuten.
Entfernen Sie dann das Fixiermittel und waschen Sie die Proben dreimal für jeweils 10 Minuten mit DPBS. Nach dem Entfernen des PBS 500 Mikroliter Blockierlösung pro Vertiefung hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie dann die Blocklösung.
Um die Phalloidin-Färbelösung herzustellen, verdünnen Sie die 400-fache Lagerlösung auf 1-fach mit PBS. Geben Sie 200 Mikroliter Phalloidin-Färbelösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Holen Sie dann die Färbelösung zurück und waschen Sie die Proben 10 Minuten lang mit DPBS.
Nachdem Sie das PBS entfernt haben, nehmen Sie das Deckglas mit einer Spritzennadel heraus und lassen Sie es an der Luft trocknen. Tragen Sie eine kleine Menge Montagemedium auf den Objektträger auf und drehen Sie das Deckglas vorsichtig auf dem Objektträger, um sicherzustellen, dass das Medium die gesamte Oberfläche gleichmäßig bedeckt. Versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack.
Es wurden tunnelnde Nanoröhren oder TNT-Strukturen beobachtet, die interzelluläre Verbindungen zwischen ähnlichen und unterschiedlichen Zelltypen herstellen. Ein mitochondrialer Transfer wurde in ARPE-19-Zellen mit grün gepunkteter Fluoreszenz von MSCs und in MSCs mit rot gepunkteter Fluoreszenz von ARPE-19-Zellen beobachtet. Die hochauflösende Bildgebung bestätigte die Bildung von TNTs und einen detaillierten mitochondrialen Transfer über TNTs.
Die Quantifizierung zeigte, dass MSCs im Vergleich zu ARPE-19-Zellen signifikant besser in der Lage waren, Mitochondrien zu spenden.
